S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Djakovas
įvedimas
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - vėlyvosios pūtimo, ekonomiškai svarbiausios bulvių ir pomidorų ligos, sukėlėjas daugiau nei pusantro šimtmečio sulaukė daugelio šalių mokslininkų dėmesio. XIX amžiaus viduryje staiga pasirodęs Europoje, jis sukėlė bulvių epidemiją, kuri išliko daugelio kartų atmintyje.
Iki šiol jis dažnai vadinamas „Airijos bado grybu“. Praėjus beveik šimtui metų nuo pirmųjų epidemijų, buvo atrastos laukinėms Meksikos laukinėms bulvių rūšims, atsparios vėlyvam marui, buvo sukurti būdai, kaip jas kirsti su auginamomis bulvėmis (Muller, 1935), ir gautos pirmosios atsparios vėlyvojo purvo veislėms (Pushkarev, 1937). Tačiau netrukus po jų komercinio auginimo pradžios susikaupė vėlyvosios ligos sukėlėjo, kuris buvo atsparus atsparios veislėms, rasės. naujų laukinių Meksikos bulvių atsparumo genų įvedimas į veisles pradėjo greitai prarasti efektyvumą.
Nesėkmės naudojant monogeninį (vertikalų) atsparumą, privertė veisėjus ieškoti sudėtingesnių nespecifinio poligeninio (horizontalaus) atsparumo panaudojimo būdų. Pastaraisiais metais labai agresyvios rasės pradėjo kauptis atskirose parazito populiacijose, sukeldamos net nespecifinio atsparumo eroziją. Atsiradus atspariems fungicidams štamams, kilo problemų naudojant bulvių apsaugines chemines medžiagas.
Dėl reikšmingų oomicetų ir grybų cheminės sudėties, ultrastruktūros ir metabolizmo skirtumų fungicidai, ypač sisteminiai, naudojami augalams apsaugoti nuo daugelio grybelinių ligų, yra neveiksmingi nuo oomicetų.
Todėl cheminei apsaugai nuo vėlyvosios pūtimo buvo naudojamas daugkartinis (iki 12 kartų per sezoną ar daugiau) purškimas plačia veikimo spektro kontaktiniais preparatais. Revoliucinis žingsnis buvo fenilamidų naudojimas, kurie yra toksiški oomicetams ir sistemingai plinta augaluose. Tačiau dėl jų plataus naudojimo grybelių populiacijose greitai kaupėsi atsparios padermės (Davidse ir kt., 1981), o tai gerokai apsunkino augalų apsaugą. P. infestans yra praktiškai vienintelis vidutinio klimato zonos parazitas, kurio žala ekologinėje žemdirbystėje negali būti neutralizuota nenaudojant cheminių apsaugos priemonių (Van Bruggen, 1995).
Tai paaiškina didžiulį įvairių šalių tyrėjų dėmesį P. infestans populiacijų tyrimams, jų gausos ir genetinės sudėties dinamikai, taip pat genetiniams kintamumo mechanizmams.
R. INFESTANS gyvenimo ciklas
Oomycete Phytophthora infestans bulvių lapų viduje išsivysto tarpląstelinė grybiena su haustoria. Maitindamasis lapų audiniais, susidaro tamsios dėmės, kurios drėgnu oru pajuoduoja ir supūva. Su stipriu pralaimėjimu visas lapas miršta. Po maitinimo laikotarpio ant grybelio susidaro ataugos - sporangioforos, kurios per stomatas auga į išorę. Drėgnu oru jie formuoja baltą žiedą aplink dėmeles lapų apačioje. Sporangioforų galuose susidaro citrinos formos zoosporangijos, kurios lūžta ir nešamos purškiant lietui (1 pav.). Patekusios į vandens lašus ant bulvių lapo paviršiaus, sporangės dygsta 6–8 zoosporomis, kurios po tam tikro judėjimo laikotarpio yra suapvalintos, padengtos lukštu ir dygsta daigelio vamzdeliu. Daigas per stomatą prasiskverbia į lapų audinį. Tam tikromis sąlygomis sporangijos gali augti mėgintuvėlyje tiesiai į lapų audinį. Esant palankioms sąlygoms, laikas nuo užkrėtimo iki naujos sporuliacijos susidarymo yra tik 3-4 dienos.
Sporangės, patekusios į žemę ir filtruotos per dirvą, gali užkrėsti gumbus. Labai nukentėję gumbai laikymo metu pūna; silpnai paveiktoje infekcija gali tęstis iki kito sezono. Be to, vėlyvosios pūtimo sukėlėjas žiemą gali išlikti oosporų (storasienių poilsio lytinių sporų) pavidalu dirvožemyje ant augalų liekanų ir ant pomidorų sėklų. Oosporos susidaro ant gyvų augalų organų, kai skirtingų poravimosi rūšių kamienai susiduria su per didele drėgme. Pavasarį ant pasodintų užkrėstų gumbų ir augalų liekanų su oosporomis susidaro nelytinė sporuliacija; zoosporos patenka į dirvą ir sukelia apatinių augalų lapų užkrėtimą. Kai kuriais atvejais grybiena gali užaugti iš užkrėsto gumbo palei žaliąją augalo dalį ir dažniausiai atsiranda viršutinėje stiebo dalyje.
Reikšmingas oomicetų ir daugelio grybų skirtumas yra tas, kad jų gyvenimo cikle vyrauja diplofazės su gametine mejoze ir zigotų (oosporų) daigumas be redukcinio branduolio dalijimosi. Atrodo, kad ši savybė ir biseksualumą pakeičiantis dipolinis heterotalizmas leistų oomicetoms pritaikyti metodus, sukurtus aukštesnių eukariotų populiacijoms tirti (paniksijos ir populiacijų suskirstymo analizė, vidaus ir interpopuliacijos genų srautai ir kt.). Tačiau trys veiksniai neleidžia visiškai perkelti šių požiūrių į P. infestans populiacijų tyrimą.
1. Kartu su hibridinėmis oosporomis populiacijose susidaro savaime derlingos ir partenogenetinės oosporos (Fife ir Shaw, 1992; Anikina ir kt., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003), o jų susidarymo dažnis gali būti pakankamas įtakai apie bandymo rezultatus.
2. P. infestans lytinis procesas nežymiai prisideda prie populiacijos dydžio dinamikos, nes grybas dauginasi daugiausia vegetacinėmis sporomis, sudarant daugiau kaip 90% poravimosi tipo analizės rezultatų tradiciniu metodu maistinėje terpėje. ... vegetacijos metu kelios nelytinės sporuliacijos kartos (policiklinės ligos vystymasis). Oosporos vaidina svarbų vaidmenį išsaugant organizmą tuo laikotarpiu, kai nėra žalių augalų (žiemą), ir pirminėje daigų infekcijoje. Tada vasaros metu vyksta klonų dauginimasis ir padidėja arba, priešingai, sumažėja atskirų klonų, atsiradusių dėl lytinės rekombinacijos, skaičius, kurį daugiausia lemia labiau pritaikytųjų pasirinkimas. Todėl atskirų klonų santykis populiacijoje epifitikų pradžioje ir pabaigoje gali būti visiškai kitoks.
3. Aprašytas ciklas būdingas gimtosioms P. infestans populiacijoms jų tėvynėje, Centrinėje Amerikoje. Kitose pasaulio vietose lytinis procesas nebuvo žinomas daugiau nei 100 metų; vegetatyvinė grybiena užkrėstuose bulvių gumbuose buvo žiemojimo laikotarpis. Gyvenimo ciklas buvo visiškai agamus, o plitimas buvo židinio pobūdžio: infekcija iš pavienių užkrėstų pasodintų gumbų perėjo į lapus, formuodama pirminius ligos židinius, kurie galėjo susilieti masiškai vystantis ligai.
Taigi kai kuriuose regionuose gali vykti lytinio ir nelytinio ciklo kaita, o kituose - tik nelytinis ciklas.
P. INFESTANS kilmė
P. infestansas Europoje atsirado XIX amžiaus pirmosios pusės pabaigoje. Kadangi bulvė yra gimtoji į šiaurės rytinę Pietų Amerikos dalį, buvo manoma, kad parazitas buvo atvežtas iš ten į Europą Čilės salietros bumo metu. Tačiau tyrimai, atlikti Rokfelerio centro bulvių stotyje Tolucos slėnyje, Meksikoje, privertė šį požiūrį peržiūrėti (Niederhauser, 1991, 1993).
1. Tolucos slėnyje vietinės gumbinės bulvių rūšys (Solanum demissum, S. bulbocastanum ir kt.) Turi skirtingus vertikalaus pasipriešinimo genų rinkinius kartu su aukštu nespecifinio atsparumo lygiu, o tai rodo ilgą kartu su parazitu vykstančią evoliuciją. Pietų Amerikos rūšims, įskaitant pasėlių bulves, trūksta atsparumo genų.
2. Tolucos slėnyje randami A1 ir A2 poravimosi tipų izoliatai, dėl kurių paplitusi tarpkrautinė P. infestans populiacija; o gimtojoje auginamų bulvių šalyje, Pietų Amerikoje, parazitas plinta kloniškai.
3. Tolucos slėnyje yra kasmet sunkios vėlyvojo pūtimo epidemijos. Todėl tarp Šiaurės Amerikos tyrėjų (Kornelio universitetas) nusistovėjo nuomonė apie Mesoamerica (Centrinė Amerika) kaip bulvių fitoftoros gimtinę (Goodwin ir kt., 1994).
Pietų Amerikos tyrėjai nepritaria šiai nuomonei. Jie mano, kad auginama bulvė ir jos parazitas P. infestans turi bendrą tėvynę - Pietų Amerikos Andus. Jie palaikė savo požiūrį atlikdami molekulinius tyrimus, analizuodami mitochondrijų genomo (mtDNR) ir branduolinių genų RAS bei β-tubulino DNR polimorfizmus (Gomez-Alpizar et al., 2007). Jie parodė, kad iš skirtingų pasaulio vietų surinktos padermės kilo iš trijų skirtingų protėvių linijų, kurios (visos trys) yra Pietų Amerikos Anduose. Andų haplotipai yra dviejų linijų palikuonys: seniausių mtDNR giminės izoliatai yra laukiniuose Solanaceae iš Anarrhicomenum sekcijos Ekvadore, o antrosios linijos izoliatai yra paplitę ant bulvių, pomidorų ir laukinių nakvišų. Tolucoje net reti haplotipai yra kilę tik iš vienos giminės, o genetinis Toluca padermių kintamumas (mažas kai kurių kintamų vietų alelinis dažnis) rodo stiprų pagrindinį poveikį dėl neseniai vykusio dreifo.
Be to, Anduose buvo rasta nauja P. andina rūšis, morfologiškai ir genetiškai panaši į P. infestans, kuri, pasak autorių, nurodo Andus kaip į karštą Phytophthora genties spekuliacijos vietą. Galiausiai Europoje ir JAV P. infestans populiacijose yra abi Andų giminės, o Tolucoje - tik viena.
Šis leidinys paskatino įvairių šalių tyrėjų grupės atsakymą, kuris atliko daug eksperimentinio darbo, norėdamas patikslinti ankstesnį tyrimą (Goss ir kt., 2014). Šiame darbe, pirma, DNR polimorfizmams tirti buvo naudojamos labiau informatyvios mikrosatelitų DNR sekos; antra, klasterių analizei, migracijos keliams, populiacijų išsiskyrimo laikui ir kt. Buvo naudojami pažangesni modeliai (F statistika, Bajeso aproksimacijos ir kt.), trečia, palyginimas buvo atliktas ne tik su Andų rūšimi P. andina, kurioje nustatyta hibridinė prigimtis (P. infestans x Phytophthora sp.) , bet ir su Meksikos endeminėmis rūšimis P. mirabilis, P. Ipomoeae ir Phytophthora phaseoli - genetiškai artimi P. infestans, priklausantys tai pačiai kladei (Kroon et al., 2012). Dėl šių analizių buvo vienareikšmiškai įrodyta, kad visų į tyrimą paimtų Phytophthora genties rūšių filogenetinio medžio šaknies dalis, išskyrus hibridinį P. andina, priklauso Meksikos padermėms, o migracijos srautas turi Meksikos - Andų kryptį, o ne atvirkščiai, o jo pradžia sutampa su Europos Naujojo pasaulio kolonizacija (prieš 300–600 metų). Taigi bulvių nugalėjimui specializuotų P. infestans rūšių atsiradimas įvyko antriniame gumbinių nakvišų formavimosi genetiniame centre, t. Centrinėje Amerikoje.
P. INFESTANS genomas
2009 m. Tarptautinė mokslininkų komanda nustatė visą P infestans genomą (Haas ir kt., 2009), kurio dydis buvo 240 MB. Tai yra kelis kartus daugiau nei artimųjų rūšių P. sojae (95 Mb), sukeliančių sojų šaknų puvinį, ir P. Ramorum (65 Mb), paveikdamas tokias vertingas medžių rūšis kaip ąžuolas, bukas ir kai kurios kitos. Gauti duomenys parodė, kad genome yra daug pakartotų sekų kopijų - 74 proc. Genome yra 17797 baltymus koduojantys genai, kurių dauguma yra genai, dalyvaujantys ląstelių procesuose, įskaitant DNR replikaciją, baltymų transkripciją ir transliaciją.
Palyginus Phytophthora genties genomus, nustatyta neįprasta genomo organizacija, susidedanti iš konservuotų genų sekų blokų, kuriuose genų tankis yra santykinai didelis, o pasikartojančių sekų kiekis yra santykinai mažas, ir atskiruose regionuose, kuriuose nėra konservuotų genų sekų, mažas genų tankis ir didelis pasikartojančių regionų kiekis. Konservatyvūs blokai sudaro 70% (12440) visų P. infestans baltymus koduojančių genų. Konservatyviuose blokuose genai paprastai yra glaudžiai išdėstyti, vidutinis tarpgeninis atstumas yra 604 bp. Teritorijose tarp konservatyvių blokų tarpgeninis atstumas yra didesnis (3700 bp) dėl pasikartojančių elementų tankio padidėjimo. Greitai besivystantys efektorių sekreciniai genai yra neturtinguose regionuose.
P. Infestanso genomo sekos analizė parodė, kad maždaug trečdalis genomo priklauso perkeliamiems elementams. P. infestans genome yra žymiai daugiau skirtingų transpozonų šeimų nei kituose žinomuose genomuose. Dauguma P. infestans transposonų priklauso čigonų šeimai.
P. infestans genome nustatyta daug specifinių genų šeimų, dalyvaujančių patogenezėje. Nemaža jų dalis koduoja efektorinius baltymus, kurie keičia augalo-šeimininko fiziologiją ir prisideda prie jo infekcijos. Jie priklauso dviem plačioms kategorijoms: apoplastiniai efektoriai, veikiantys tarpląstelinėse erdvėse (apoplastai), ir citoplazmos efektoriai, kurie į ląsteles patenka per haustoria. Apoplastiniai efektoriai apima išskiriamus hidrolizinius fermentus, tokius kaip proteazės, lipazės ir glikozilazės, naikinančios augalų ląsteles; augalų šeimininkų gynybinių fermentų inhibitoriai ir nekrotizuojantys toksinai, pavyzdžiui, į Nep1 panašūs baltymai (NPL) ir į Pcf panašūs maži cisteino turintys baltymai (SCR).
P. infestans efektorių genų yra daug ir jie paprastai yra didesni už nepatogeninius genus. Garsiausi yra citoplazmos efektoriai RXLR ir Crinkler (CNR). Tipiški oomicetų citoplazmos efektoriai yra RXLR baltymai. Visi iki šiol atrasti RXLR efektoriniai genai turi amino galinę grupę Arg-XLeu-Arg, kur X yra aminorūgštis. Tyrimo rezultatas buvo pasiūlyta, kad P. infestans genome yra 563 RXLR genai, tai yra 60% daugiau nei P. sojae ir P. ramorum. Maždaug pusė P. infestans genomo RXLR genų yra būdingi rūšiai. RXLR efektoriai turi pačias įvairiausias sekas. Tarp jų buvo nustatyta viena daugiavaikė ir 150 mažų šeimų. Skirtingai nuo pagrindinio proteomo, RXLR efektoriniai genai paprastai yra genų neturtingose ir pakartotinai turtinguose genomo regionuose. Mobilieji elementai, lemiantys šių regionų dinamiškumą, palengvina šių genų rekombinaciją.
Citoplazminiai CRN efektoriai iš pradžių buvo identifikuoti P. infestans transkriptuose, koduojančiuose augalų audinių nekrozės peptidus. Nuo jų atradimo mažai žinoma apie šių efektorių šeimą. Analizuojant P. Infestans genomą, nustatyta didžiulė 196 CRN genų šeima, kuri yra žymiai didesnė nei P. sojae (100 CRN) ir P. ramorum (19 CRN). Kaip ir RXLR, CRN yra moduliniai baltymai ir susideda iš labai konservatyvaus N-galinio LFLAK domeno (50 amino rūgščių) ir gretimo DWL domeno, kuriame yra skirtingų genų. Dauguma CRN (60%) turi signalinį peptidą.
Ištirta įvairių CRN galimybė sutrikdyti augalo-šeimininko ląstelinius procesus. Analizuojant augalų nekrozę, pašalinus CRN2 baltymus, buvo galima nustatyti C-galinę sritį, susidedančią iš 234 aminorūgščių (173-407 pozicijos, DXG domenas) ir sukeliančią ląstelių mirtį. P. infestans CRN genų analizė atskleidė keturis skirtingus C galo regionus, kurie taip pat sukelia ląstelių mirtį augale. Tai apima naujai nustatytus DC domenus (P. Infestansas turi 18 genų ir 49 pseudogenus), taip pat D2 (14 ir 43) ir DBF (2 ir 1) domenus, kurie yra panašūs į baltymų kinazes. Augale ekspresuoti CRN domenų baltymai yra konservuojami (jei nėra signalinių peptidų) augalo ląstelėje ir stimuliuoja ląstelių mirtį viduląsteliniu mechanizmu. Dar 255 sekos, kuriose yra CRN domenų, greičiausiai neveikia kaip genai.
RXLR ir CRN efektorių genų šeimų skaičiaus ir dydžio padidėjimą veikiausiai nulėmė ne paralelinė homologinė rekombinacija ir genų dubliavimasis. Nepaisant to, kad genome yra daug aktyvių mobiliųjų elementų, vis dar nėra tiesioginių efektorinių genų perdavimo įrodymų.
Gyventojų struktūros tyrime naudojami metodai
Populiacijų genetinės struktūros tyrimas šiuo metu yra pagrįstas grynųjų jo padermių kultūrų analize. Populiacijų analizė, neišskiriant grynų pasėlių, taip pat atliekama konkretiems tikslams, pavyzdžiui, tiriant populiacijos agresyvumą ar fungicidams atsparių padermių buvimą joje (Filippov et al., 2004; Derevyagina et al., 1999). Šio tipo tyrimai apima specialių metodų naudojimą, kurių aprašymas nepatenka į šios apžvalgos sritį. Palyginamajai padermių analizei naudojami keli metodai, pagrįsti tiek DNR struktūros analize, tiek fenotipinių apraiškų tyrimu. Lyginamoji populiacijų analizė turi būti susijusi su daugeliu izoliatų, o tai nustato tam tikrus reikalavimus taikomiems metodams. Idealiu atveju jie turėtų atitikti šiuos reikalavimus (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- būti pigus, lengvai įgyvendinamas, nereikalaujantis didelių laiko sąnaudų, pagrįstas visuotinai prieinamomis technologijomis (pavyzdžiui, PGR);
- turi generuoti pakankamai daug nepriklausomų kodominantinių žymenų požymių;
- pasižymi dideliu atkuriamumu;
- sunaudoti mažiausią tiriamų audinių kiekį;
- būdingos substratui (kultūroje esantis užterštumas neturėtų turėti įtakos rezultatams);
- nereikia naudoti pavojingų procedūrų ir labai toksiškų chemikalų.
Deja, nėra metodų, atitinkančių visus aukščiau nurodytus parametrus. Palyginamam mūsų laikų štamų tyrimui naudojami metodai, pagrįsti fenotipinių požymių analize: bulvių ir pomidorų veislių virulencija (bulvių ir pomidorų rasės), poravimosi tipu, peptidazės izofermentų ir gliukozės-6-fosfato izomerazės spektrais bei DNR struktūros analize: ilgio polimorfizmas restrikcijos fragmentas (RFLP), kuris paprastai papildomas hibridizacijos zondu RG 57, mikrosatelitų pasikartojimų (SSR ir InterSSR) analizė, amplifikacija atsitiktiniais pradmenimis (RAPD), restrikcijos fragmentų amplifikacija (AFLP), amplifikacija gruntais, homologiškais judančių elementų sekoms (pavyzdžiui, Inter SINE PCR), mitochondrijų DNR haplotipų nustatymas.
Trumpas padermių palyginamojo tyrimo, naudojamo darbe su P. Infestansu, metodų aprašymas
Fenotipiniai žymenų bruožai
„Bulvių“ lenktynės
„Bulvių“ rasės yra dažniausiai tiriamas ir naudojamas žymeklis. „Paprastų bulvių“ rasėse yra vienas bulvių virulentiškumo genas, „sudėtingose“ - mažiausiai du. Black ir kt. (1953), apibendrinę visus turimus duomenis, nustatė, kad fitoftoros rasė gali užkrėsti augalus atsparumo genais / genais, atitinkančiais P. infestans virulentiškumo geną / genus, ir nustatė 1, 2, 3 ir 4 rases, kurios užkrėtė augalus su atitinkamai R1, R2, R3 ir R4 genais, t.y. parazito ir šeimininko sąveika vyksta pagal geno geno principą. Be to, Blackas, dalyvaujant Gallegly ir Malcolmson, atrado atsparumo genus R5, R6, R7, R8, R9, R10 ir R11, taip pat atitinkamas rases (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Yra daugybė duomenų apie įvairių regionų sukėlėjo rasinę sudėtį. Neanalizavę šių duomenų išsamiai, nurodysime tik bendrą tendenciją: ten, kur buvo naudojamos veislės su naujais atsparumo genais ar jų deriniais, iš pradžių šiek tiek susilpnėjo vėlyvasis pūtimas, tačiau vėliau atsirado ir buvo atrinktos rasės su atitinkamais virulentiškumo genais ir vėl prasidėjo vėlyvosios pūtimo protrūkiai. Specifinis virulentiškumas prieš pirmuosius 4 atsparumo genus (R1-R4) buvo retai pastebimas kolekcijose, surinktose prieš pradedant auginti veisles su šiais genais, tačiau virulentiškų padermių skaičius smarkiai išaugo, kai patogenas parazitavo ant veislių, turinčių šiuos genus. Kita vertus, genai 5–11 buvo gana dažni kolekcijose (Shaw, 1991).
1980-ųjų pabaigoje atliktas skirtingų rasių santykio vegetacijos metu tyrimas parodė, kad ligos vystymosi pradžioje populiacijoje vyrauja klonai, kurių agresyvumas yra mažas ir 1–2 virulentiškumas.
Be to, vystantis vėlyvam pūtimui, sumažėja pradinių klonų koncentracija ir padidėja „sudėtingų“ rasių, turinčių didelį agresyvumą, skaičius. Pastarųjų atsiradimas iki sezono pabaigos siekia 100%. Laikant gumbus, sumažėja agresyvumas ir prarandami atskiri virulentiškumo genai. Klonų pakeitimo dinamika gali pasireikšti skirtingomis veislėmis įvairiais būdais (Rybakova ir Dyakov, 1990). Tačiau mūsų tyrimai 2000–2010 m. Parodė, kad sudėtingos rasės yra randamos nuo pat epifitozės pradžios tarp padermių, izoliuotų tiek iš bulvių, tiek iš pomidorų. Tikriausiai taip yra dėl P. Infestans populiacijos pasikeitimo Rusijoje.
Iki 1988–1995 m. „Super rasių“ su visais ar beveik visais virulentiškumo genais dažnumas įvairiuose regionuose pasiekė 70–100%. Tokia situacija pastebėta, pavyzdžiui, Baltarusijoje, Leningrado, Maskvos regionuose, Šiaurės Osetijoje ir Vokietijoje (Ivanyuk ir kt., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin ir kt., 1995).
„Pomidorų“ lenktynės
Pomidorų veislėse buvo rasti tik 2 atsparumo vėlyvai pūtimui genai - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) ir Ph2 (Al-Kherb, 1988). Kaip ir bulvių rasių atveju, pomidorų ir P. infestans sąveika vyksta po geną. T0 rasė užkrečia veisles, neturinčias atsparumo genų (dauguma pramoniniu būdu naudojamų veislių), T1 rasė veisia Ph1 geną (Otava), o T2 rasė - Ph2 geną.
Rusijoje beveik vien T0 buvo rasta ant bulvių; Sezono pradžioje pomidorams vyravo T0, tačiau vėliau jį pakeitė T1 lenktynės (Dyakov et al., 1975, 1994). Po 2000 m. Bulvių T1 daugelyje populiacijų pradėjo atsirasti pačioje epifitozės pradžioje. Jungtinėse Amerikos Valstijose bulvių padermės nebuvo patogeniškos pomidorams, taip pat T0, T1 ir T2 rasės, o pomidorams vyravo T1 ir T2 (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin ir kt., 1995).
Poravimosi tipas
Tyrimui atlikti reikalingos žinomos poravimosi rūšys - A1 ir A2. Tiriamasis izoliatas užkrėstas poromis Petri lėkštelėse su avižų agaro terpe. Po inkubacijos 10 dienų plokštelėse tiriama, ar štamų kontaktinėje zonoje terpėje nėra oosporų. Galimi 4 variantai: padermė priklauso A1 poravimosi tipui, jei ji formuoja oosporas su A2 testeriu, A2, jei formuoja oosporas su A1 testeriu, A1A2, jei ji formuoja oosporas su abiem testeriais, arba yra sterili (00), jei ji nesudaro oosporų be testerio (dvi paskutinės grupės yra retos).
Norint greičiau nustatyti poravimosi tipus, buvo bandoma nustatyti genomo regionus, susijusius su poravimosi tipu, siekiant jų tolesnio naudojimo siekiant nustatyti poravimosi tipą PGR. Vieną iš pirmųjų sėkmingų eksperimentų tokiai vietai nustatyti atliko Amerikos tyrėjai (Judelson ir kt., 1995). Taikydami RAPD metodą, jie sugebėjo nustatyti W16 regioną, susietą su poravimosi tipu dviejų sukryžiuotų izoliatų palikuoniuose, ir suprojektuoti porą 24 bp pradmenų jo amplifikacijai (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') ir W16-2 (5'). -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Apribojus PGR produktą restrikcijos fermentu „HaeIII“, buvo galima atskirti izoliatus su susiejimo tipais A1 ir A2.
Dar vieną bandymą gauti PGR žymenis, kad būtų galima nustatyti poravimosi tipus, ėmėsi Korėjos tyrėjai (Kim, Lee, 2002). Jie nustatė konkrečius produktus naudodami AFLP metodą. Dėl to buvo sukurta pradmenų pora PHYB-1 (į priekį) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') ir PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), leidžianti selektyviai sustiprinti genomo sritį, susijusią su A2 poravimosi tipu. Vėliau jie tęsė šį darbą ir sukūrė pradmenis 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, į priekį) ir 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), leidžiančius selektyviai išplėsti Mat-A1 sritį, būdingą padermėms su poravimosi tipu. A1. Tiriant P. infestans populiacijas Čekijos Respublikoje (Mazakova ir kt., 2006), Tunise (Jmour, Hamada, 2006) ir kituose regionuose, poravimosi tipų PGR diagnostikos naudojimas parodė gerus rezultatus. Mūsų laboratorijoje („Mytsa“, „Elansky“, nepublikuota) buvo išanalizuotos 34 P. infestans padermės, išskirtos iš sergančių bulvių ir pomidorų organų skirtinguose Rusijos regionuose (Kostromos, Riazanės, Astrachanės ir Maskvos regionuose). PGR analizės, naudojant specifinius pradmenis, daugiau nei 90%, rezultatai sutapo su poravimosi tipo analizės tradiciniu metodu maistinių medžiagų terpėje rezultatais.
1 lentelė. Atsparumo Sib 1 klone variacija (Elansky ir kt., 2001)
Mėginių surinkimo vieta | Analizuotų izoliatų skaičius | Jautrių (S), silpnai atsparių (SR) ir atsparių (R) padermių skaičius, vnt (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostokas | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutskas | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarskas | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Jekaterinburgo miestas | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sachalinas | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Omsko sritis | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Atsparumas metalaksilui kaip populiacijos žymeklis
1980-ojo dešimtmečio pradžioje įvairiuose regionuose buvo pastebėti galingi vėlyvojo pūtimo protrūkiai, kuriuos sukėlė metalaksilui atsparios P. infestans padermės. Bulvių ūkiai daugelyje šalių patyrė didelių nuostolių (Dowley & O'Sullivan, 1981; Davidse ir kt., 1983; Derevyagina, 1991). Nuo to laiko daugelyje pasaulio šalių nuolat kontroliuojamas fenilamidui atsparių padermių atsiradimas P. infestans populiacijose. Be praktinio fenilamido turinčių vaistų vartojimo perspektyvų įvertinimo, apsaugos priemonių sistemos sukūrimo ir epifitų prognozavimo, atsparumas šiems vaistams tapo vienu iš žymenų, plačiai naudojamų lyginant šio patogeno populiacijų analizę. Tačiau lyginamuosiuose populiacijos tyrimuose atsparumas metalaksilui turėtų būti atliekamas atsižvelgiant į tai, kad: 1 - genetinis atsparumo pagrindas dar nėra tiksliai nustatytas, 2 - atsparumas metalaksilui yra selektyviai priklausomas bruožas, kuris gali skirtis priklausomai nuo fenilamidų vartojimo, 3 - skirtingas jautrumo metalaksilo padermėms laipsnis vienoje kloninėje linijoje (1 lentelė).
Izozimų spektrai
Izozimo žymenys paprastai nepriklauso nuo išorinių sąlygų, rodo Mendelio paveldėjimą ir yra kodominantiniai, leidžiantys atskirti homo- ir heterozigotas. Baltymų naudojimas kaip genų žymenis leidžia nustatyti didelius genetinės medžiagos pertvarkymus, įskaitant chromosomų ir genomų mutacijas, ir pavienių aminorūgščių pakaitalus.
Elektroforeziniai baltymų tyrimai parodė, kad dauguma fermentų organizmuose yra kelių frakcijų pavidalu, kurie skiriasi elektroforetiniu judrumu. Šios frakcijos yra daugelio fermentų formų kodavimo rezultatas pagal skirtingus lokusus (izozimus ar izozimus) arba skirtingus to paties lokuso alelius (alozimus arba aloenzimus). Tai yra, izozimai yra skirtingos vieno fermento formos. Skirtingos formos turi tą patį katalizinį aktyvumą, tačiau šiek tiek skiriasi dėl vienos amino rūgšties pakaitalų peptide ir atsakingoje. Tokie skirtumai atsiskleidžia elektroforezės metu.
Tiriant P. infestans padermes, naudojami dviejų baltymų - peptidazės ir gliukozės-6-fosfato izomerazės - izofermentų spektrai (šis fermentas Rusijos populiacijose yra monomorfiškas, todėl jo tyrimo metodai šiame darbe nepateikti). Norėdami juos išskirti į izozimus elektriniame lauke, baltymų preparatai, išskirti iš tirtų organizmų, dedami į elektriniame lauke įdėtą gelio plokštelę. Atskirų baltymų difuzijos greitis gelyje priklauso nuo krūvio ir molekulinės masės, todėl elektriniame lauke baltymų mišinys yra padalijamas į atskiras frakcijas, kurias galima vizualizuoti naudojant specialius dažus.
Peptidazės izofermentų tyrimas atliekamas su celiuliozės-acetato, krakmolo ar poliakrilamido geliais. Patogiausias būdas yra „Helena Laboratories Inc.“ pagamintas celiuliozės acetato gelių naudojimas. Tai nereikalauja didelių bandomųjų medžiagų kiekių, ji leidžia gauti gelio kontrastingas juostas po elektroforezės abiem fermentų lokusams, jo įgyvendinimas nereikalauja didelių laiko ir medžiagų sąnaudų (2 pav.).
Nedidelis grybienos gabalėlis perkeliamas į 1,5 ml mikrovamzdelį, į jį įpilama 1-2 lašai distiliuoto vandens. Po to mėginys homogenizuojamas (pavyzdžiui, elektriniu gręžtuvu su plastikiniu priedu, tinkamu mikrovamzdeliui) ir 25 sekundes nusodinamas centrifugoje esant 13000 aps./min. 8 μl iš kiekvieno mikrovamzdelio. supernatantas perkeliamas į aplikatoriaus plokštelę.
Celiuliozės acetato gelis pašalinamas iš buferinės talpyklos, ištrinamas tarp dviejų filtravimo popieriaus lapų ir uždedamas darbiniu sluoksniu ant aplikatoriaus plastiko pagrindo. Tirpalas iš plokštelės aplikatoriumi perkeliamas ant gelio 2–4 kartus. Gelis perkeliamas į elektroforezės kamerą,
2 lentelė. Tirpalo, naudojamo celiuliozės acetato geliui dažyti, analizuojant peptidazės izofermentus, sudėtis, ant gelio krašto dedamas lašas dažų (bromfenolio mėlynos spalvos).
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0, 2 ml
Peroksidazė, 1000 V / ml 5 lašai
o-dianisidinas, 4 mg / ml 8 lašai
MgCl2, 20 mg / ml 2 lašai
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 lašų
L-aminorūgščių oksidazė, 20 vienetų / ml 2 lašai
Elektroforezė atliekama 20 minučių. esant 200 V. esant elektroforezei, gelis perkeliamas ant dažymo stalo ir dažomas specialiu dažymo tirpalu (2 lentelė). 10 ml 1,6% DIFCO agaro iš anksto ištirpinama mikrobangų krosnelėje, atvėsinama iki 60 ° C, po to 2 ml agaro sumaišoma su dažų mišiniu ir supilama ant gelio. Juostelės atsiranda per 15-20 minučių. L-aminorūgščių oksidazės reagentas pridedamas prieš pat maišant tirpalą su išlydytu agaru.
Rusijos populiacijose Pep 1 lokusą vaizduoja genotipai 100/100 ir 92/100. Homozigota 92/92 yra ypač reta (apie 0,1%). „Locus Rehr 2“ atstovauja trys genotipai 100/100, 100/112 ir 112/112, ir visi 3 variantai yra gana dažni (Elanky ir Smirnov, 2003, 2 pav.).
Genomo tyrimai
Ribojimo fragmento ilgio polimorfizmas su vėlesne hibridizacija (RFLP-RG 57)
Bendra DNR apdorojama EcoR1 restrikcijos fermentu, DNR fragmentai atskiriami elektroforeze agarozės gelyje. Branduolinė DNR yra labai didelė ir turi daugybę pasikartojančių sekų, todėl sunku tiesiogiai išanalizuoti daugybę fragmentų, gautų veikiant restrikcijos fermentams. Todėl gelyje atskirti DNR fragmentai perkeliami į specialią membraną ir naudojami hibridizacijai su RG 57 zondu, kuris apima radioaktyviomis arba fluorescuojančiomis etiketėmis pažymėtus nukleotidus. Šis zondas hibridizuojasi su pasikartojančiomis genominėmis sekomis (Goodwin ir kt., 1992, Forbes ir kt., 1998). Vizualizavus hibridizacijos šviesoje arba radioaktyvioje medžiagoje rezultatus, gaunamas daugelio vietų hibridizacijos profilis (pirštų atspaudai), kurį vaizduoja 25–29 fragmentai (Forbes ir kt., 1998). Nelytiniai (kloniniai) palikuonys turės tuos pačius profilius. Juostų išdėstymas elektroforetogramoje naudojamas vertinant palygintų organizmų panašumus ir skirtumus.
Mitochondrijų DNR haplotipai
Daugumoje eukariotų ląstelių mtDNR yra dvigubos grandinės formos žiedinės DNR molekulės pavidalu, kuri, skirtingai nei eukariotų ląstelių branduolinės chromosomos, dauginasi pusiau konservatyviai ir nėra susijusi su baltymų molekulėmis.
Mitochondrijų P. infestans genomas buvo sekvenuotas, o nemažai darbų buvo skirta restrikcijos fragmentų ilgių analizei (Carter et al, 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Po to, kai Griffithas ir Shawas (1998) sukūrė paprastą ir greitą metodą mtDNR haplotipams nustatyti, šis žymeklis tapo vienu populiariausių P. Infestanso tyrimuose. F2-R2 (4 lentelė) ir jų vėlesnis restrikcijos fermentais MspI (4 fragmentas) ir EcoR3 (1 fragmentas). Metodas leidžia nustatyti 1 haplotipus: Ia, IIa, Ib, IIb. II tipas nuo I tipo skiriasi tuo, kad yra 2 bp intarpas ir skirtinga restrikcijos vietų vieta P4 ir P1881 regionuose (2 pav.).
Nuo 1996 m. Tarp Rusijos teritorijoje surinktų padermių pastebėti tik Ia ir IIa haplotipai (Elansky ir kt., 2001, 2015). Juos galima nustatyti atskyrus restrikcijos produktus gruntu F2-R2 elektriniame lauke (4, 5 pav.). MtDNR tipai naudojami lyginant padermių ir populiacijų analizę. Atliekant daugybę tyrimų, kloninėms linijoms išskirti ir P. infestans izoliatams pasportizuoti buvo naudojami mitochondrijų DNR tipai (Botez et al., 2007; Shein et al., 2009). Taikant PCR-RFLP metodą, padaryta išvada, kad mtDNR yra heterogeninė toje pačioje P. infestans padermėje (Elansky ir Milyutina, 2007). Amplifikacijos sąlygos: 1x (500 sek. 94 ° C), 40x (30 sek. 90 ° C, 30 sek. 52 ° C, 90 sek. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reakcijos mišinys: (20 μl): 0,2 U Taq DNR polimerazės, 1x 2,5 mM MgCl2-Taq buferio, 0,2 mM kiekvienos dNTP, 30 pM pradmenų ir 5 ng analizuojamos DNR, dejonizuoto vandens - iki 20 μl.
PGR produkto ribojimas atliekamas 4-6 valandas 37 ° C temperatūroje. Ribojamasis mišinys (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x restrikcinis buferis (2 μl), dejonizuotas vanduo (6 μl), PCR produktas (10 μl).
3 lentelė. MtDNR polimorfinių sričių amplifikacijai naudojami pradmenys
Locus | Gruntas | Grunto ilgis ir vieta | PGR produkto ilgis | Restriktazė |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619–13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688–14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329–9350 | 964 | „EcoRI“ |
R4: 5 – CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292–10271 |
Atsitiktinis pradmenų stiprinimas (RAPD)
Vykdant RAPD, naudojamas vienas pradmuo (kartais keli pradmenys vienu metu) su savavališku, paprastai 10 nukleotidų ilgio, nukleotidų seka, turinčia daug (nuo 50%) GC nukleotidų ir žema atkaitinimo temperatūra (apie 35 ° C). Tokie pradmenys „nusileidžia“ ant daugybės papildomų genomo vietų. Po amplifikacijos gaunama daugybė amplikonų. Jų skaičius priklauso nuo naudojamo (-ų) pradmens (-ų) ir reakcijos sąlygų (MgCl2 koncentracijos ir atkaitinimo temperatūros).
Amplikonų vizualizacija atliekama distiliuojant poliakrilamido arba agarozės gelyje. Atliekant RAPD analizę, būtina atidžiai stebėti analizuojamos medžiagos grynumą, nes užteršimas kitais gyvais daiktais gali žymiai padidinti artefaktų skaičių, kurių yra gana daug analizuojant gryną medžiagą (Perez ir kt., 1998). Šio metodo naudojimas tiriant P. infestans genomą atsispindi daugelyje darbų (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Reakcijos sąlygų ir pradmenų parinkimas (buvo tiriamas 51 10 nukleotidų pradmenų) pateiktas Abu-El Samen ir kt. (2003) straipsnyje.
Mikrosatelito pakartotinė analizė (SSR)
Mikrosatelitiniai pasikartojimai (paprastos sekos pasikartojimai, SSR) yra kartotinai kartojamos 1-3 (kartais iki 6) nukleotidų sekos, esančios visų eukariotų branduolio genomuose. Pakartotinių pasikartojimų skaičius gali svyruoti nuo 10 iki 100. Mikrosatelitiniai lokusai atsiranda gana dažnai ir yra daugiau ar mažiau tolygiai pasiskirstę po genomą (Lagercrantz ir kt., 1993). Mikrosatelitų sekų polimorfizmas siejamas su pagrindinio motyvo pakartojimų skaičiaus skirtumais. Mikrosatelitų žymekliai yra kodominantiniai, todėl juos galima naudoti analizuojant populiacijos struktūrą, nustatant giminystę, genotipo migracijos kelius ir kt. Be kitų šių žymenų pranašumų, reikia atkreipti dėmesį į jų aukštą polimorfizmą, gerą atkuriamumą, neutralumą ir galimybę atlikti automatinę analizę ir vertinimą. Mikrosatelitų pakartojimų polimorfizmo analizė atliekama PGR amplifikacija, naudojant pradmenis, papildančius unikalias mikrosatelitų lokusų sekas. Iš pradžių analizė buvo atliekama atskiriant reakcijos produktus ant poliakrilamido gelio. Vėliau „Applied Biosystems“ darbuotojai pasiūlė naudoti fluorescenciškai paženklintus pradmenis su reakcijos produktų aptikimu naudojant automatinį lazerinį detektorių (Diehl ir kt., 1990), o tada standartinius automatinius DNR sekvencerius (Ziegle ir kt., 1992). Gruntų žymėjimas įvairiais fluorescuojančiais dažais leidžia analizuoti kelis žymenis vienu metu vienoje juostoje ir atitinkamai žymiai padidinti metodo produktyvumą ir padidinti analizės tikslumą.
Pirmosios publikacijos, skirtos SSR analizės naudojimui P. infestans tyrimams, pasirodė 2000-ųjų pradžioje. (Knapova, Gisi, 2002). Ne visi autorių pasiūlyti žymekliai parodė pakankamą polimorfizmo laipsnį, tačiau du iš jų (4B ir G11) buvo įtraukti į 12 SSR žymenų rinkinį, kurį pasiūlė Lees ir kt. (2006), o vėliau jie buvo priimti „Eucablight“ tyrimų tinkle (www.eucablight). .org) kaip standartas P. infestans. Po kelerių metų buvo paskelbtas tyrimas dėl P. infestans DNR multipleksinės analizės sistemos, pagrįstos aštuoniais SSR žymenimis, sukūrimo (Li ir kt., 2010). Galiausiai, įvertinusi visus anksčiau pasiūlytus žymenis ir pasirinkusi informatyviausius iš jų, taip pat optimizavusi pradmenis, fluorescencines etiketes ir amplifikacijos sąlygas, ta pati autorių grupė pateikė vieno etapo multipleksinės analizės sistemą, įskaitant 12 žymenų (4 lentelė; Li ir kt. , 2013a). Šioje sistemoje naudojami pradmenys buvo pasirinkti ir pažymėti vienu iš keturių fluorescuojančių žymenų (FAM, VIC, NED, PET), kad gruntų su tomis pačiomis etiketėmis alelių dydžių diapazonai nesutaptų.
Autoriai atliko PTC200 stiprintuvo (MJ Research, JAV) analizę, naudodami QIAGEN multipleksinius PGR rinkinius arba QIAGEN Typeit Microsatellite PGR rinkinius. Reakcijos mišinio tūris buvo 12.5 μL. Amplifikacijos sąlygos buvo tokios: QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min.), 30x (95 ° C (20 sek.), 58 ° C (90 sek.), 72 ° C (60 sek.), 72 ° C (20 min.); QIAGEN Type-it mikrosatelito PCR: 95 ° C (5 min.), 28x (95 ° C (30 sek.), 58 ° C (90 sek.), 72 ° C (20 sek.), 60 ° C (30 min.).
PGR produktų atskyrimas ir vizualizavimas buvo atliktas naudojant automatinį kapiliarinės DNR analizatorių ABI3730 (Applied Biosystems).
4 lentelė. 12 standartinių SSR žymenų, naudojamų genotipui nustatyti P. Infestans, charakteristikos (Li ir kt., 2013a)
Pavadinimas | Alelių skaičius | Dydžių diapazonas aleliai (bp) | Gruntai |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
ft02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTACAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
ft04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
ft70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
ft63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Analizės rezultatų vizualizavimo pavyzdys parodytas fig. 6. Rezultatai buvo analizuojami naudojant „GeneMapper 3.7“ programinę įrangą, lyginant gautus duomenis su žinomų izoliatų duomenimis. Norint palengvinti analizės rezultatų interpretavimą, į kiekvieną tyrimą būtina įtraukti 1-2 etaloninius izoliatus su žinomu genotipu.
Siūlomas tyrimo metodas buvo išbandytas naudojant daugybę lauko mėginių. Po to autoriai atliko dviejų organizacijų - The James Hutton Institute (JK) ir Wageningen University & Research (Nyderlandai) - laboratorijų standartizavimo protokolus, kurie kartu su galimybe naudoti paprastas LPS korteles supaprastintai surinkimas ir persiuntimas P. infestans DNR mėginių leido kalbėti apie galimybę komerciškai naudoti šią plėtrą. Be to, greitas ir tikslus P. infestans izoliatų genotipo nustatymo metodas, naudojant daugialypę SSR analizę, leido atlikti standartizuotus šio patogeno populiacijos tyrimus pasauliniu mastu ir sukurti „Eucablight“ projekto (www.eucablight.org), įskaitant vėlyvojo pūtimo, pasaulinę duomenų bazę. , įskaitant mikrosatelitų analizės rezultatus, leido stebėti naujų genotipų atsiradimą ir plitimą visame pasaulyje.
Amplifikuotas restrikcijos fragmento ilgio polimorfizmas (AFLP). AFLP (amplifikuoto fragmento ilgio polimorfizmas) yra atsitiktinių molekulinių žymenų generavimo technologija, naudojant specifinius pradmenis. AFLP metu DNR gydoma dviejų restrikcijos fermentų deriniu. Specifiniai adapteriai susiejami su lipniais restrikcijos fragmentų galais.
Tada šie fragmentai yra amplifikuojami naudojant pradmenis, komplementarius adapterio sekai ir restrikcijos vietai ir papildomai nešant vieną ar daugiau atsitiktinių bazių jų 3 'galuose. Gautų fragmentų rinkinys priklauso nuo restrikcijos fermentų ir atsitiktinai parinktų nukleotidų pradmenų 3'-galuose (Vos ir kt., 1995). AFLP - genotipai naudojami norint greitai ištirti įvairių organizmų genetinę variaciją.
Išsamus metodo aprašymas pateiktas Muellerio, Wolfenbarger, 1999, Savelkoul ir kt., 1999. darbuose. Kinijos tyrėjai atliko daug darbo, lygindami AFLP ir SSR metodų skiriamąją gebą. Buvo tiriamos 48 P. infestans izoliatų, surinktų penkiuose Šiaurės Kinijos regionuose, fenotipinės ir genotipinės savybės. Remiantis AFLP spektrais, buvo identifikuojami aštuoni skirtingi DNR genotipai, priešingai nei SSR genotipai, kurių įvairovė nebuvo atskleista (Guo ir kt., 2008).
Stiprinimas gruntais, homologiški mobiliųjų elementų sekoms
Žymekliai, gauti iš retrotranspozonų sekų, yra labai patogūs genetiniam kartografavimui, genetinės įvairovės ir evoliucinių procesų tyrimui (Schulman, 2006). Jei pradmenys yra pagaminti taip, kad papildytų stabilias tam tikrų judančių elementų sekas, galima sustiprinti tarp jų esančius genomo regionus. Tiriant vėlyvosios pūtimo sukėlėją, sėkmingai buvo naudojamas genomo regionų amplifikavimo būdas, naudojant gruntą, papildantį pagrindinę SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) retroazono seką (Lavrova ir Elansky, 2003). Taikant šį metodą, buvo atskleisti net nelytiniai vieno izoliatoriaus palikuonys. Šiuo atžvilgiu padaryta išvada, kad tarp SINE ir PGR metodas yra labai specifinis, o SINE elementų judėjimo greitis Phytophthora genome yra didelis.
P. infestans genome nustatyta 12 trumpų retrotranspozonų (SINE) šeimų; buvo tiriamas trumpųjų retrotranspozonų rūšinis pasiskirstymas, nustatyti elementai (SINE), kurie randami tik P. infestans genome (Lavrova, 2004).
Padermių lyginamojo tyrimo metodų taikymo ypatybės populiacijos tyrimuose
Planuojant tyrimą būtina aiškiai suprasti jo siekiamus tikslus ir naudoti tinkamus metodus. Taigi kai kurie metodai leidžia generuoti daugybę nepriklausomų žymenų ženklų, tačiau tuo pat metu jie yra mažai atkuriami ir labai priklauso nuo naudojamų reagentų, reakcijos sąlygų ir tiriamos medžiagos užteršimo. Todėl atliekant kiekvieną padermių grupės tyrimą būtina naudoti keletą standartinių (etaloninių) izoliatų, tačiau net ir šiuo atveju kelių eksperimentų rezultatus labai sunku derinti.
Šiai metodų grupei priklauso RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Po amplifikacijos gaunama daug skirtingų dydžių DNR fragmentų. Tokius metodus patartina naudoti, jei būtina nustatyti glaudžiai susijusių padermių (tėvų palikuonių, laukinio tipo mutantų ir kt.) Skirtumus arba tais atvejais, kai reikalinga išsami mažo mėginio analizė. Taigi AFLP metodas plačiai naudojamas atliekant P. infestans genetinį kartografavimą (van der Lee ir kt., 1997) ir atliekant intrapopuliacijos tyrimus (Knapova, Gisi, 2002, Cooke ir kt., 2003, Flier ir kt., 2003). Tokių metodų netinka naudoti kuriant padermių duomenų bazes, nes atliekant analizę skirtingose laboratorijose, praktiškai neįmanoma suvienodinti rezultatų apskaitos.
Nepaisant tariamo vykdymo paprastumo ir greičio (DNR išskyrimas be gero išgryninimo, amplifikacijos, rezultatų vizualizavimo), šiai metodų grupei rezultatams dokumentuoti reikia naudoti specialų metodą: distiliacija poliakrilamido gelyje su paženklintais (radioaktyviais arba liuminescenciniais) pradmenimis ir tolesnis šviesos ar radioaktyviųjų medžiagų poveikis. Įprastiniai etidžio bromido agarozės gelio vaizdai paprastai netinka šiems metodams, nes gali susilieti didelis skaičius skirtingų dydžių DNR fragmentų.
Kiti metodai, priešingai, leidžia generuoti nedaug funkcijų, kurių atkūrimas labai aukštas. Ši grupė apima mitochondrijų DNR haplotipų tyrimus (Rusijoje pastebimi tik du Ia ir IIa haplotipai), poravimosi tipus (dauguma izoliatų skirstomi į 2 tipus: A1 ir A2, savaime derlingą SF randama retai) ir peptidazės izozimo spektrus (du lokusai Pep1 ir Pep2 , susidedantis iš dviejų izozimų kiekvienoje) ir gliukozės-6-fosfato izomerazės (Rusijoje šio bruožo kintamumas nėra, nors kitose pasaulio šalyse pastebimas reikšmingas polimorfizmas). Šias funkcijas patartina naudoti analizuojant kolekcijas, kaupiant regionines ir pasaulines duomenų bazes. Atliekant mitochondrijų DNR izozimų ir haplotipų analizę, galima apsieiti be standartinių padermių, tuo tarpu analizuojant poravimosi tipus reikalingi du bandomieji izoliatai su žinomais poravimosi tipais.
Reakcijos sąlygos ir reagentai gali paveikti tik produkto kontrastą elektroforetogramoje; artefaktų pasireiškimas tokio tipo tyrimuose yra mažai tikėtinas.
Šiuo metu didžiąją dalį Europos europinės Rusijos populiacijos atstovauja abiejų rūšių poravimosi atmainos (6 lentelė), tarp jų yra izoliatorių su mitochondrijų DNR Ia ir IIa tipais (kitų tipų mtDNR, aptiktų pasaulyje po 1993 m., Rusijoje nerasta). Peptidazės izozimų spektrus Pep1 lokusas vaizduoja dviem genotipais (100/100, 92/92 ir heterozigotai 92/100, o 92/92 genotipas yra labai retas (<0,3%)) ir dviem genotipais Pep 2 lokuse (100/100 , 112/112 ir heterozigota 100/112, o genotipas 112/112 pasitaiko rečiau nei 100/100, bet taip pat gana dažnai).
Po 6 m. Gliukozės-1993-fosfato izomerazės izofermentų spektro kintamumas nebuvo (kloninės linijos US-1 išnykimas); visi tirti izoliatai turėjo 100/100 genotipą (Elansky ir Smirnov, 2002).
Trečioji metodų grupė leidžia gauti pakankamą nepriklausomų žymenų grupių grupę, kuri būtų gerai atkuriama. Šiandien šiai grupei priklauso RFLP-RG57 zondas, kuris gamina 25–29 įvairaus dydžio DNR fragmentus. RFLP-RG57 galima naudoti tiek analizuojant mėginius, tiek rengiant duomenų bazes. Tačiau šis metodas yra daug brangesnis nei ankstesni, jis užima daug laiko ir reikalauja pakankamai didelio kiekio išgrynintos DNR. Todėl tyrėjas yra priverstas riboti bandomos medžiagos tūrį.
RFLP-RG57 plėtra praėjusio amžiaus 90-ųjų pradžioje žymiai sustiprino vėlyvosios ligos sukėlėjo populiacijos tyrimus. Tai tapo metodo pagrindu, paremtu „Kloninių linijų“ parinkimu ir analize (žr. Toliau). Kartu su RFLP-RG57 kloninėms linijoms identifikuoti naudojamas poravimosi tipas, DNR pirštų atspaudai (RFLP-RG57 metodas), peptidazės ir gliukozės-6-fosfato izomerazės izofermentų spektrai ir mitochondrijų DNR tipas. Jo dėka buvo parodyta al., 1994), senų populiacijų pakeitimas naujomis (Drenth ir kt., 1993, Sujkowski ir kt., 1994, Goodwinas ir kt., 1995a), buvo nustatytos daugelyje pasaulio šalių vyraujančios kloninės linijos. Rusijos kamienų tyrimai naudojant šį metodą parodė didelį genotipinį padermių polimorfizmą Europos dalyje ir populiacijų monomorfizmą Rusijos Azijos ir Tolimųjų Rytų dalyse (Elansky et al, 2001). Ir dabar šis metodas išlieka pagrindinis P. infestans populiacijos tyrimuose. Tačiau jo platinimą trukdo gana didelės išlaidos ir darbo intensyvumas vykdant.
Kita perspektyvi technika, kuri retai naudojama P. infestans tyrimuose, yra mikrosatelitų pakartojimo (SSR) analizė. Šiuo metu šis metodas plačiai naudojamas kloninėms linijoms izoliuoti. Padermių analizei buvo plačiai naudojami (ir tebevartojami) tokie fenotipiniai žymenų bruožai kaip virulentiškumo genų buvimas bulvių veislėms (Avdey, 1995, Ivanyuk ir kt., 2002, Ulanova ir kt., 2003) ir pomidorams. Iki šiol bulvių veislių virulentiškumo genai prarado savo vertę kaip populiacijos tyrimų žymenį, nes didžiojoje daugumoje izoliatų atsirado maksimalus (arba beveik toks pat) virulentiškumo genų skaičius. Tuo pačiu metu pomidorų veislių T1 virulentiškumo genas, turintis atitinkamą Ph1 geną, vis dar sėkmingai naudojamas kaip žymėjimo bruožas (Lavrova ir kt., 2003; Ulanova ir kt., 2003).
Daugelyje tyrimų atsparumas fungicidams naudojamas kaip žymeklis. Ši savybė yra nepageidaujama naudoti atliekant populiacijos tyrimus dėl gana lengvo atsparumo mutacijų atsiradimo kloninėse linijose, naudojant lauke metalaksilo (arba mefenoksamo) turinčius fungicidus. Pavyzdžiui, reikšmingi atsparumo lygio skirtumai buvo parodyti Sib1 kloninės linijos viduje (Elansky ir kt., 2001).
Taigi poravimosi tipas, peptidazės izozimo spektras, mitochondrijų DNR tipas, RFLP-RG57, SSR yra pirmenybiniai žymenų bruožai kuriant duomenų bankus ir žymint padermes kolekcijose. Jei norite palyginti ribotus pavyzdžius, jei reikia pritaikyti maksimalų žymeklių skaičių, galite naudoti AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (5 lentelė). Tačiau reikia atsiminti, kad šie metodai yra blogai atkuriami ir kiekviename atskirame eksperimente (amplifikacijos elektroforezės cikle) būtina naudoti kelis etaloninius izoliatus.
5 lentelė. Įvairių padermių tyrimo metodų palyginimas P. Infestansas
kriterijus | TC tikrasis narys | „Isofer“ policininkai | MtDNR | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | rev |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Informacijos kiekis | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Atkuriamumas | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Artefaktų galimybė | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Kaina | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Darbo intensyvumas | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Analizės greitis ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Pastaba: H - žemas, C - vidutinis, B - aukštas; НС * - darbo intensyvumas yra mažas, kai naudojamas agarozės gelis arba automatinis
vidutinis genotipas - distiliuojant poliakrilamido gelyje su paženklintais pradmenimis,
** - neskaičiuojant laiko, skirto grybienos auginimui DNR išskyrimui.
Gyventojų struktūra
Kloninės linijos
Nesant rekombinacijos ar jos nereikšmingo indėlio į populiacijos struktūrą, populiacija susideda iš tam tikro skaičiaus klonų, tarp kurių genetiniai mainai yra labai reti.
Tokiose populiacijose labiau informatyvu tirti ne atskirų genų, o genotipų, turinčių bendrą kilmę (kloninės linijos arba kloninės linijos) ir besiskiriančių tik taškinėmis mutacijomis, dažnį. Vėlinių pūtimo sukėlėjo populiacijos tyrimai ir kloninių linijų analizė gerokai paspartėjo nuo to laiko, kai praėjusio amžiaus 57-ųjų pradžioje atsirado RFLP-RG90 metodas. Kartu su RFLP-RG57 kloninėms linijoms identifikuoti naudojamas poravimosi tipas, peptidazės ir gliukozės-6-fosfato izomerazės izofermentų spektrai ir mitochondrijų DNR tipas. Dažniausių kloninių linijų charakteristikos parodytos 6 lentelėje.
JAV-1 klonas visur dominavo populiacijose iki aštuntojo dešimtmečio pabaigos, po to jį pradėjo keisti kiti klonai ir dingo iš Europos bei Šiaurės Amerikos. Dabar jis yra Tolimuosiuose Rytuose (Filipinai, Taivanas, Kinija, Japonija, Korėja, Koh et al., 80, Mosa ir kt., 1994), Afrikoje (Uganda, Kenija, Ruanda, Goodwin ir kt., 1993, Vega-Sanchez et. al., 1994; Ochwo ir kt., 2000) ir Pietų Amerikoje (Ekvadoras, Brazilija, Peru, Forbes ir kt., 2002, Goodwin ir kt., 1997). Vien Australijoje nenustatyta štamų, priklausančių JAV-1994 linijai. Akivaizdu, kad P. infestans izoliatai į Australiją atėjo su kita migracijos banga (Goodwin, 1).
6-ųjų pabaigoje JAV-70 klonas iš Meksikos šiaurės migravo į Kaliforniją ir po 32 metų be ligų sukėlė bulvių ir pomidorų epidemiją. Dėl didelio agresyvumo jis išstūmė kloną US-1 ir pradėjo dominuoti vakarinėje JAV pakrantėje (Goodwin et al., 1995a).
Genotipai US-7 ir US-8 buvo atrasti JAV 1992 m., O jau 1994 m. Buvo plačiai paplitę JAV ir Kanadoje. Per vieną lauko sezoną US-8 klonas sugeba beveik visiškai išstumti US-1 kloną bulvių sklypuose, iš pradžių užkrėstuose abiem klonais vienoda koncentracija (Miller ir Johnson, 2000).
Klonai BC-1 - BC-4 buvo nustatyti Britų Kolumbijoje, nedaugeliui izoliatų iš Goodwin ir kt., 1995b). Klonas US-11 plačiai paplito JAV ir išstūmė JAV-1 Taivane. Klonai JP-1 ir EC-1 kartu su klonu US-1 yra paplitę atitinkamai Japonijoje ir Ekvadore (Koh et al., 1994; Forbes et al., 1997).
SIB-1 yra klonas, vyravęs Rusijoje didžiulėje teritorijoje nuo Maskvos srities iki Sachalino. Maskvos regione jis buvo atrastas 1993 m., O kai kurias lauko populiacijas daugiausia sudarė šios kloninės linijos padermės, labai atsparios metalaksilui. Po 1993 m. Šio klono paplitimas žymiai sumažėjo. Už Uralo ribų 1997–1998 metais SIB-1 buvo rastas visur, išskyrus Chabarovsko teritoriją (klonas SIB-2 ten plačiai paplitęs). Erdvinis klonų su skirtingų tipų poravimu atskyrimas neįtraukia seksualinio proceso Sibire ir Tolimuosiuose Rytuose. Maskvos srityje, priešingai nei Sibire, gyventojams atstovauja daugybė klonų; beveik kiekvienas izoliatas turi unikalų daugiafokusį genotipą (Elansky ir kt., 2001, 2015). Šios įvairovės negalima paaiškinti vien grybelio padermių importu iš skirtingų pasaulio vietų su importuota sėkline medžiaga. Kadangi populiacijoje pasitaiko abiejų tipų poravimosi, gali būti, kad jo įvairovę lemia ir rekombinacija. Taigi, Britų Kolumbijoje prielaida, kad dėl BC-2 ir US-3 klonų hibridizacijos atsiranda BC-4, BC-1 ir BC-6 genotipai (Goodwin ir kt., 1995b). Gali būti, kad hibridinių padermių yra Maskvos populiacijose. Pvz., PE-lokusui heterozigotinės MO-4, MO-8 ir MO-11 padermės gali būti hibridai tarp MO-12, MO-21, MO-22 padermių, turinčių A2 poravimosi tipą ir homozigotiniai vienam PEP lokuso ir padermės aleliui. MO-8, turintis A1 poravimosi tipą ir homozigotas kitam lokuso aleliui. Ir jei taip yra, o šiuolaikinėse P. infestans populiacijose yra tendencija į lytinio proceso vaidmens padidėjimą, tada daugiafokusių klonų analizės informacinė vertė sumažės (Elansky et al., 2001, 2015).
Kloninių linijų kitimas
Iki XX a. 90-ųjų dešimtmečio kloninė linija US-20 buvo plačiai paplitusi pasaulyje. Daugumą lauko ir regioninių populiacijų sudarė tik US-1 genotipo padermės. Tačiau pastebėti ir izoliatų skirtumai, kuriuos greičiausiai sąlygojo mutacinis procesas. Mutacijos įvyko tiek branduolyje, tiek mitochondrijų DNR ir, be kita ko, turėjo įtakos atsparumo fenilamidiniams vaistams lygiui ir virulentiškumo genų skaičiui. Linijos, kurios skiriasi nuo pirminių genotipų mutacijomis, nurodomos papildomais skaičiais po tašku, einančiu po pirminio genotipo pavadinimo (pavyzdžiui, US-1 mutacinė linija US-1.1 kloninės linijos). Pirštų atspaudų DNR linijose US-1 ir US-1.5 yra skirtingų dydžių priedų linijos (Goodwin ir kt., 1.6a, 1995b); kloninė linija US-1995 taip pat skiriasi nuo US-6.3 viena priedų linija (Goodwin, 6, 1997 lentelė).
Tiriant mitochondrijų DNR nustatyta, kad kloninėje linijoje US-1 randama tik 1b tipo mitochondrijų DNR (Carter ir kt., 1990). Tačiau tiriant šios kloninės giminės iš Peru ir Filipinų padermes buvo rasta izoliatų, kurių mitochondrijų DNR tipai nuo 1b skyrėsi dėl intarpų ir delecijų buvimo (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
6 lentelė. Daugelio židinių kai kurių P. infestans kloninių linijų genotipai
Pavadinimas | Poravimosi tipas | Izozimai | DNR pirštų atspaudai | MtDNR tipas | |
GPI | PEP | ||||
JAV 1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 + 24 | Ib |
JAV 2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
JAV 3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 + 24 | - |
JAV 4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 + 24 | - |
JAV 5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
JAV 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 + 24 | IIb |
JAV 7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
JAV 8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
JAV 9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
JAV 10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
JAV 11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIb |
JAV 12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | - |
JAV 14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 + 24 | - |
JAV 15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
JAV 16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 + 24 | - |
JAV 17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 + 24 | - |
JAV 18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
JAV 19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
EB-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
Pastaba: * - nėra duomenų.
7 lentelė. Daugiafokusiai genotipai ir jų mutantinės linijos
Pavadinimas | Poravimosi tipas | | DNR pirštų atspaudai (RG57) | Pažymi, | |
GPI | PEP-1 | ||||
JAV 1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Originalus 1 genotipas |
JAV 1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutacija PEP |
JAV 1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacija RG57 |
JAV 1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutacija RG57 |
JAV 1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | RG57 ir PEP mutacija |
JAV 1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutacija RG57 |
JAV 6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Originalus 2 genotipas |
JAV 6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutacija PEP |
JAV 6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutacija RG57 |
JAV 6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutacija RG57 |
JAV 6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | RG57 ir PEP mutacija |
JAV 6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutacija RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Originalus 3 genotipas |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutacija RG57 |
Taip pat yra izozimų spektrų pokyčių. Paprastai juos sukelia organizmas, iš pradžių šiam fermentui heterozigotas, suskaidomas į homozigotinius. 1993 m. Pomidorų vaisiuose nustatėme padermę, kuriai būdingos US-1 charakteristikos: RG57 pirštų atspaudai, mitochondrijų DNR tipas ir 86/100 gliukozės-6-fosfatizomerazės genotipas, tačiau jis buvo homozigotinis (100/100) pirmajam peptidazės lokusui, o ne šiai kloninei linijai būdingas 92/100 heterozigotas. Pavadinome šios padermės genotipą MO-17 (6 lentelė). Mutantinės linijos US-1.1 ir US-1.4 taip pat skiriasi nuo US-1 pagal pirmojo peptidazės lokuso mutacijas (7 lentelė).
Mutacijos, lemiančios bulvių ir pomidorų veislių virulentiškumo genų skaičiaus pokyčius, yra gana dažnos. Jie buvo pastebėti tarp kloninės linijos US-1 izoliatų populiacijose iš Olandijos (Drenth et al., 1994), Peru (Goodwin et al., 1995a), Lenkijos (Sujkowski et al., 1991), Šiaurės Šiaurės Amerikos (Goodwin et al. ., 1995b). Bulvių virulentiškumo genų skaičiaus skirtumai taip pat pastebėti tarp kloninių linijų US-7 ir US-8 izoliatų Kanadoje ir JAV (Goodwin ir kt., 1995a), tarp SIB-1 linijos izoliatų Rusijos Azijos dalyje (Elansky ir kt., 2001 ).
Izoliatai, kurių atsparumo fenilamidiniams vaistams lygis labai skiriasi, buvo nustatyti monokloninio lauko populiacijose, kurios visos priklausė kloninei Sib-1 linijai (Elansky ir kt., 2001, 1 lentelė). Beveik visos kloninės linijos US-1 padermės yra labai jautrios metalaksilui, tačiau labai atsparūs šios linijos izoliatai buvo išskirti Filipinuose (Koh et al., 1994) ir Airijoje (Goodwin et al., 1996).
Šiuolaikinės P. infestans populiacijos
Centrinė Amerika (Meksika)
P. infestans populiacija Meksikoje labai skiriasi nuo kitų pasaulio populiacijų, pirmiausia dėl savo istorinės padėties. Daugybė šios populiacijos ir susijusių P. infestans klimato Phytophthora rūšių, taip pat vietinių Solanum genties rūšių tyrimų leido daryti išvadą, kad patogeno raida centrinėje Meksikos dalyje vyko kartu su augalų šeimininkų evoliucija ir buvo susijusi su lytine rekombinacija (Grünwald, Flier , 2005). Abi poravimosi rūšys yra atstovaujamos populiacijoje ir vienodomis proporcijomis, o oosporų buvimas dirvožemyje, ant bulvių augalų ir laukinių gumbų bei laukinių augalų augančių giminingų rūšių Solanum patvirtina lytinio proceso buvimą populiacijoje (Fernández-Pavía et al., 2002). Naujausi Tolucos slėnio ir jo apylinkių (įtariamo patogeno kilmės centro) tyrimai patvirtino didelę P. infestans vietinės populiacijos genetinę įvairovę (134 daugiafokusiai genotipai 176 mėginių mėginyje) ir kelių diferencijuotų pogrupių buvimą regione (Wang ir kt., 2017). Veiksniai, lemiantys šią diferenciaciją, yra teritorinis pogrupių pasiskirstymas, būdingas centrinės Meksikos aukštikalnėms, auginimo sąlygų ir slėniuose bei kalnuose naudojamų bulvių veislių skirtumai ir laukinių gumbinių Solanum rūšių, kurios gali veikti kaip alternatyvūs šeimininkai, skirtumai (Fry ir kt. ., 2009).
Tačiau reikia pažymėti, kad šiaurinėje Meksikoje esančių P. infestans populiacijos yra gana kloniškos ir labiau panašios į Šiaurės Amerikos populiacijas, o tai gali reikšti, kad tai yra nauji genotipai (Fry ir kt., 2009).
Северная Америка
Šiaurės Amerikos P. infestans populiacijos visada buvo labai paprastos struktūros, o jų kloninis pobūdis buvo nustatytas ilgai prieš naudojant mikrosatelitų analizę. Iki 1987 m. JAV ir Kanadoje dominavo kloninė linija US-1 (Goodwin ir kt., 1995). Aštuntojo dešimtmečio viduryje, pasirodžius metalaksilo pagrindu pagamintiems fungicidams, šį kloną pradėjo keisti kiti atsparesni genotipai, kurie migravo iš Meksikos (Goodwin ir kt., 70). Iki 1998-ųjų pabaigos. JAV-90 genotipas visiškai pakeitė JAV-8 genotipą JAV ir tapo dominuojančia klonų linija bulvėse (Fry ir kt., 1; Fry ir kt., 2009). Kitokia padėtis buvo su pomidorais, kuriuose nuolat buvo kelios kloninės linijos, o jų sudėtis kasmet keitėsi (Fry ir kt., 2015).
2009 m. Jungtinėse Valstijose kilo didelė vėlyvosios pomidorų epidemijos epidemija. Šios pandemijos bruožas buvo jos beveik vienu metu atsiradimas daugelyje vietų JAV šiaurės rytuose, ir paaiškėjo, kad tai siejama su didžiuliais užkrėstų pomidorų daigų pardavimais dideliuose sodo centruose (Fry ir kt., 2013). Derliaus nuostoliai buvo milžiniški. Atlikus paveiktų mėginių mikrosatelitinę analizę paaiškėjo, kad pandemijos padermė priklausė kloninės linijos US-22 A2 tipo poravimuisi. 2009 m. Šio genotipo dalis amerikiečių P. infestans populiacijoje siekė 80% (Fry ir kt., 2013). Vėlesniais metais agresyvių US-23 (daugiausia pomidorų) ir US-24 (bulvių) genotipų dalis populiacijoje nuolat didėjo, tačiau po 2011 m. JAV-24 aptikimo rodiklis žymiai sumažėjo, o iki šiol apie 90% patogenų populiacijos Jungtinėms Valstijoms atstovauja JAV-23 genotipas (Fry ir kt., 2015).
90-ųjų pabaigoje Kanadoje, kaip ir JAV. dominuojantį genotipą US-1 išstūmė US-8, kurio dominuojanti padėtis nepakito iki 2008 m. 2009–2010 m. Kanadoje kilo rimtų vėlyvųjų epidemijų, susijusių su užkrėstų pomidorų daigų pardavimu, tačiau jas sukėlė US-23 ir US-8 genotipai (Kalischuk et al., 2012). Aiškus geografinis šių genotipų diferenciacija buvo puikus: JAV-23 dominavo vakarinėse Kanados provincijose (68%), o JAV-8 dominavo rytinėse provincijose (83%). Vėlesniais metais JAV-23 išplito į rytinius regionus, tačiau apskritai jo dalis populiacijoje šiek tiek sumažėjo, atsižvelgiant į JAV-22 ir US-24 genotipų atsiradimą šalyje (Peters ir kt., 2014). Iki šiol JAV-23 išlaiko dominuojančią padėtį visoje Kanadoje; „US-8“ yra Britų Kolumbijoje, o „US-23“ ir „US-24“ yra Ontarijuje (Peters, 2017).
Taigi Šiaurės Amerikos P. infestans populiacijos daugiausia yra kloninės linijos. Per pastaruosius 40 metų aptiktų kloninių genotipų skaičius pasiekė 24. Nepaisant to, kad populiacijoje yra abiejų tipų poravimosi padermių, naujų genotipų atsiradimo dėl lytinės rekombinacijos tikimybė išlieka gana maža. Nepaisant to, per pastaruosius 20 metų buvo užregistruoti keli trumpalaikių rekombinantinių populiacijų atsiradimo atvejai (Gavino ir kt., 2000; Danies ir kt., 2014; Peters ir kt., 2014), o vienu atveju kryžminimo rezultatas buvo genotipas US-11. , kuris daugelį metų buvo įsitvirtinęs Šiaurės Amerikoje (Gavino ir kt., 2000). Iki 2009 m. Populiacijos struktūros pokyčiai buvo siejami su naujų, agresyvesnių genotipų atsiradimu ir jų vėlesne migracija bei anksčiau dominavusių pirmtakų perkėlimu. Kas nutiko 2009–2010 m JAV ir Kanadoje epifitotikai pirmą kartą parodė, kad globalizacijos eroje ligos protrūkiai gali būti siejami su aktyviu naujų genotipų plitimu parduodant užkrėstą sodinamąją medžiagą.
Pietų Amerika
Dar neseniai Pietų Amerikos P. infestans populiacijų tyrimai nebuvo nei reguliarūs, nei plataus masto. Yra žinoma, kad šių populiacijų struktūra yra gana paprasta ir apima 1–5 klonines linijas kiekvienai šaliai (Forbes ir kt., 1998). Taigi 1998 m. Ant bulvių buvo rasti genotipai US-1 (Brazilija, Čilė) BR-1 (Brazilija, Bolivija, Urugvajus, Paragvajus), EC-1 (Ekvadoras, Kolumbija, Peru ir Venesuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 ir AR-5 (Argentina), PE-3 ir PE-7 (Pietų Peru). Poravimosi tipas A2 buvo Brazilijoje, Bolivijoje ir Argentinoje ir nebuvo rastas už Bolivijos ir Peru sienos Titikakos ežero rajone, už kurio Anduose dominavo EC-1 A1 genotipas. Pomidorų srityje JAV-1 išliko dominuojantis genotipas visoje Pietų Amerikoje.
2000-aisiais situacija daugmaž išliko. Svarbus momentas buvo Šiaurės Anduose atrastas laukinių augalų bulvių giminaičiams (S. brevifolium ir S. tetrapetalum) nauja A2 tipo kloninė linija EC-2 (Oliva ir kt., 2010). Filogenetiniai tyrimai parodė, kad ši linija nėra visiškai identiška P. infestans, nors yra glaudžiai su ja susijusi, dėl kurios buvo pasiūlyta ją apsvarstyti, taip pat kita linija EC-3, išskirta iš Anduose augančio pomidorų medžio S. betaceum, nauja rūšis, vadinama P. andina; tačiau šios rūšies (nepriklausomos rūšies ar P. infestans hibrido su dar nežinoma linija) būklė vis dar neaiški (Delgado ir kt., 2013).
Šiuo metu visos Pietų Amerikos P. infestans populiacijos yra kloninės. Nepaisant abiejų poravimosi tipų, nebuvo nustatyta rekombinantinių populiacijų. Pomidorų US-1 genotipas yra visur, matyt, jį nuo bulvių išstumia vietinės padermės, kurių tiksli kilmė vis dar nežinoma. Brazilijoje, Bolivijoje ir Urugvajuje yra BR-1 genotipas; Peru, kartu su US-1 ir EC-1, yra keletas kitų vietinių genotipų. Anduose dominuojančią poziciją išlaiko kloninė linija EC-1, kurios santykis su neseniai atrastu P. andina lieka nežinomas. Vienintelė „nestabili“ vieta, kur 2003–2013 m. įvyko reikšmingi gyventojų pokyčiai, tapo Čilė (Acuña ir kt., 2012), kur 2004–2005 m. patogenų populiacijai būdingas atsparumas metalaksilui ir naujas mitochondrijų DNR haplotipas (Ia vietoj anksčiau buvusio Ib). 2006–2011 m populiacijoje dominavo 21 genotipas (pagal SSR), kurio dalis pasiekė 90%, po kurio delnas perėjo į 20 genotipą, kurio pasireiškimo dažnis per ateinančius dvejus metus buvo išlaikytas maždaug 67% (Acuña, 2015).
Europa
Europos istorijoje buvo bent dvi P. infestans migracijos iš Šiaurės Amerikos bangos: XIX a. (HERB-1) ir 1 amžiaus pradžioje (US-70). 1-ajame dešimtmetyje visur buvo metalaksilo turinčių fungicidų. lėmė dominuojančio US-XNUMX genotipo išstūmimą ir jo pakeitimą naujais genotipais. Todėl daugumoje Vakarų Europos šalių ligos sukėlėjo populiacijoms daugiausia atstovavo kelios kloninės linijos.
Mikrosatelitų analizė patogenų populiacijoms analizuoti leido nustatyti rimtus pokyčius, įvykusius Vakarų Europoje 2005–2008 m., 2005 m. JK buvo atrasta nauja kloninė linija, vadinama 13_A2 (arba „Blue 13“), kuriai būdingas A2 poravimosi tipas. , didelis agresyvumas ir atsparumas fenilamidams (Shaw ir kt., 2007). Tas pats genotipas buvo rastas 2004 m. Surinktuose mėginiuose Nyderlanduose ir Šiaurės Prancūzijoje, o tai rodo, kad jis iš žemyninės Europos migravo į JK, galbūt su sėklinėmis bulvėmis (Cooke ir kt., 2007). Šios kloninės linijos atstovų genomo tyrimas parodė didelį jo sekos polimorfizmo laipsnį (iki 2016 m. Jo subkloninių variacijų skaičius pasiekė 340) ir reikšmingą genų ekspresijos lygio, t. efektoriniai genai augalų infekcijos metu (Cooke ir kt., 2012; Cooke, 2017). Šios savybės kartu su pailgėjusia biotrofinės fazės trukme gali sukelti padidėjusį 13_A2 agresyvumą ir jo gebėjimą užkrėsti net bulvių veisles, atsparias vėlyvam pūtimui.
Per ateinančius kelerius metus genotipas greitai išplito po Šiaurės Vakarų Europos šalis (Didžiąją Britaniją, Airiją, Prancūziją, Belgiją, Nyderlandus, Vokietiją), tuo pat metu perkeldamas anksčiau dominavusius genotipus 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry ir kt., 2010; Gisi ir kt. , 2011; Van den Bosch ir kt., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Anot interneto svetainės www.euroblight.net, 13_A2 dalis šių šalių populiacijose siekė 60-80% ir daugiau; šio genotipo buvimas taip pat užfiksuotas kai kuriose Rytų ir Pietų Europos šalyse. Tačiau 2009–2012 m. 13_A2 prarado dominuojančias pozicijas Didžiojoje Britanijoje ir Prancūzijoje, pasidavė 6_A1 linijai (8_A1 Airijoje), o Nyderlanduose ir Belgijoje ją iš dalies pakeitė 1_A1, 6_A1 ir 33_A2 genotipai (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Iki šiol apie 70% Vakarų Europos gyventojų P. infestans yra monokloniniai. Remiantis tinklalapiu www.euroblight.net, vyraujantys genotipai Šiaurės Vakarų Europos šalyse (JK, Prancūzijoje,
Nyderlandai, Belgija) išlieka apytiksliai lygiomis dalimis 13_A2 ir 6_A1, pastarosios praktiškai nerasta už nurodyto regiono ribų (išskyrus Airiją), tačiau jau turi mažiausiai 58 subklonus (Cooke, 2017). Variacijų 13_A2 yra pastebimai daug Vokietijoje, taip pat retai pastebimos Vidurio ir Pietų Europos šalyse. Genotipas 1_A1 sudaro didelę Belgijos, iš dalies Nyderlandų ir Prancūzijos populiacijų dalį. 8_A1 genotipas Europos populiacijoje stabilizavosi 3–6% lygiu, išskyrus Airiją, kur jis išlaiko lyderio pozicijas ir yra padalintas į du poklonus (Stellingwerf, 2017). Galiausiai 2016 m. Pastebėtas naujų genotipų 36_A2 ir 37_A2, pirmą kartą užfiksuotų 2013-2014 m., Dažnio padidėjimas; iki šiol šie genotipai yra Nyderlanduose ir Belgijoje, iš dalies Prancūzijoje ir Vokietijoje, taip pat pietinėje Didžiosios Britanijos dalyje (Cooke, 2017). Kiekvienais metais maždaug 20–30% Vakarų Europos gyventojų atstovauja unikalūs genotipai.
Skirtingai nuo Vakarų Europos, tuo metu, kai atsirado 13_A2 genotipas, Šiaurės Europos (Švedija, Norvegija, Danija, Suomija) populiacijoms buvo atstovaujama ne kloninėmis linijomis, bet daugybe unikalių genotipų (Brurberg ir kt.,
2011). Aktyvaus 13_A2 plitimo Vakarų Europoje laikotarpiu šio genotipo buvimas Skandinavijoje buvo pastebėtas tik 2011 m., Kai jis pirmą kartą buvo atrastas Šiaurės Jutlandijoje (Danija), kur daugiausia pramoninių bulvių veislės auginamos aktyviai naudojant metalaksilo turinčius fungicidai (Nielsen ir kt., 2014). Kaip rašo www.euroblight.net, 13_A2 genotipas taip pat buvo aptiktas keliuose mėginiuose iš Norvegijos ir Danijos 2014 m. Ir keliuose Norvegijos pavyzdžiuose 2016 m .; be to, 2013 m. Suomijoje pastebėtas nedidelis 6_A1 genotipo kiekis. Pagrindine 13_A2 ir kitų kloninių linijų gedimo užkariavus Skandinaviją priežastimi laikomi šio regiono klimato skirtumai nuo Vakarų Europos šalių.
Be to, kad vėsios vasaros ir šaltos žiemos prisideda prie oosporų išlikimo, o ne dėl vegetatyvinės grybienos (Sjöholm et al., 2013), dirvožemio užšalimas žiemą (kurio paprastai nebūna šiltesnėse Vakarų Europos šalyse) prisideda prie oosporų daigumo ir sodinimo sinchronizacijos. bulvių, o tai sustiprina jų, kaip pirminės infekcijos šaltinio, vaidmenį (Brurberg ir kt., 2011). Taip pat reikėtų pažymėti, kad šiaurinėmis sąlygomis oosporų infekcijos išsivystymas viršija gumbų infekcijos išsivystymą, o tai galiausiai užkerta kelią dar agresyvesnių, bet vėliau išsivysčiusių kloninių linijų dominavimui (Yuen, 2012). Labiausiai ištirtų P. infestans populiacijų struktūra Rytų Europos šalyse (Lenkijoje, Baltijos šalyse) yra labai panaši į Skandinavijoje.
Čia taip pat yra abu poravimosi tipai, o didžioji dauguma SSR analizės būdu nustatytų genotipų yra unikalūs (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Kaip ir Šiaurės Europoje, kloninių linijų (pirmiausia 13_A2 genotipo) pasiskirstymas praktiškai neturėjo įtakos vietinėms patogeno populiacijoms, kurios išlaiko aukštą įvairovės lygį, nesant ryškių dominuojančių linijų.
Laukuose, kuriuose auginamos komercinės bulvių veislės, kartais pastebima 13_A2. Rusijoje situacija vystosi panašiai. Mikrosatelitinė P. infestans izoliatų analizė, surinkta 2008-2011 m 10 skirtingų Rusijos europinės dalies regionų parodė didelį genotipų įvairovės laipsnį ir visiškai sutapimų su Europos kloninėmis linijomis trūkumą (Statsyuk et al., 2014). Po kelerių metų P. infestans mėginių, surinktų Leningrado srityje 2013–2014 m., Tyrimas parodė reikšmingus jų ir ankstesnio tyrimo metu nustatytų šio regiono genotipų skirtumus. Abiejų tyrimų metu Vakarų Europos genotipai nebuvo rasti (Beketova ir kt., 2014; Kuznetsova ir kt., 2016).
Didelę Rytų Europos populiacijų P. infestans genetinę įvairovę ir jose vyraujančių kloninių linijų nebuvimą gali lemti kelios priežastys. Pirma, kaip ir Šiaurės Europoje, nagrinėjamų šalių klimato sąlygos prisideda prie oosporų, kaip pagrindinio infekcijos šaltinio, susidarymo (Ulanova ir kt., 2010; Chmielarzas ir kt., 2014). Antra, nemaža dalis šiose šalyse užaugintų bulvių užauginamos mažuose privačiuose ūkiuose, dažnai apsupti miškų ar kitų kliūčių laisvam infekcinės medžiagos judėjimui (Chmielarz et al., 2014). Paprastai tokiomis sąlygomis užaugintos bulvės praktiškai neapdorojamos chemikalais, o veislės parenkamos atsižvelgiant į jų vėlyvą atsparumą pūtimui, t. nėra selektyvaus spaudimo agresyvumui ir atsparumui metalaksilui, kuris atima atspariems genotipams, tokiems kaip 13_A2, pranašumų prieš kitus genotipus (Chmielarz et al., 2014). Galiausiai dėl nedidelio žemės sklypų dydžio jų savininkai paprastai nepraktikuoja sėjomainos, daugelį metų augina bulves toje pačioje vietoje, o tai prisideda prie genetiškai įvairaus inokuliatoriaus kaupimosi (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Azija
Dar neseniai P. infestans populiacijos struktūra Azijoje išliko gana menkai suprantama. Buvo žinoma, kad jį daugiausia vaizduoja kloninės linijos, o seksualinės rekombinacijos poveikis naujų genotipų atsiradimui yra labai mažas. Taigi, pavyzdžiui, 1997–1998 m. Azijos Rusijos dalyje (Sibire ir Tolimuosiuose Rytuose) ligos sukėlėjų populiacijai atstovavo tik trys genotipai, kuriuose vyrauja SIB-1 genotipas (Elansky ir kt., 2001). Kloninių patogenų linijų buvimas įrodytas tokiose šalyse kaip Kinija, Japonija, Korėja, Filipinai ir Taivanas (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Didelėje Azijos teritorijoje 1-ųjų pabaigoje - 90-ųjų pradžioje dominavo kloninė linija US-2000. beveik visur pradėta keisti kitais genotipais, kurie savo ruožtu užleido vietą naujiems. Daugeliu atvejų Azijos šalių populiacijos struktūros ir sudėties pokyčiai buvo susiję su naujų genotipų migracija iš išorės. Taigi Japonijoje, išskyrus JP-3 genotipą, visi kiti japonų genotipai, atsiradę po US-1 (JP-1, JP-2, JP-3), turi daugiau ar mažiau įrodytą išorinę kilmę (Akino ir kt., 2011) ... Šiuo metu Kinijoje yra trys pagrindinės patogenų populiacijos, kurios turi aiškų geografinį pasiskirstymą; Tarp šių populiacijų nėra arba yra labai silpnas genų srautas (Guo ir kt., 2010; Li ir kt., 2013b). Genotipas 13_A2 Kinijos teritorijoje jos pietinėse provincijose (Junane ir Sičuane) pasirodė 2005–2007 m., O 2012–1014 m. buvo pastebėta ir šalies šiaurės rytuose (Li ir kt., 2013b). Indijoje 13_A2 greičiausiai atsirado tuo pačiu metu kaip ir Kinijoje, greičiausiai užkrėstomis sėklinėmis bulvėmis (Chowdappa ir kt., 2015), o 2009–2010 m. šalies pietuose sukėlė rimtą pomidorų vėlyvosios pūtimo epifitozę, po kurios ji išplito į bulves, o 2014 m. Vakarų Bengalijoje sukėlė vėlyvosios pūtimo protrūkį, dėl kurio sužlugdė ir nusižudė daugelis vietos ūkininkų (Fry, 2016).
Африка
Iki 2008-2010 m sistemingi P. infestans tyrimai Afrikos šalyse nebuvo atlikti. Šiuo metu Afrikos P. infestans populiacijas galima suskirstyti į dvi grupes, ir šis suskirstymas yra aiškiai susijęs su sėklinių bulvių importo iš Europos faktu.
Šiaurės Afrikoje, kuri aktyviai importuoja sėklines bulves iš Europos, A2 poravimosi tipas yra plačiai paplitęs beveik visuose regionuose, o tai suteikia teorinę naujų genotipų atsiradimo galimybę dėl seksualinės rekombinacijos (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Be to, Alžyre pastebimas 13_A2, 2_A1 ir 23_A1 genotipų ryškus pirmojo iš jų dominavimas, taip pat laipsniškas unikalių genotipų dalies mažėjimas iki visiško išnykimo (Rekad ir kt., 2017). Skirtingai nuo likusio regiono, Tunise (išskyrus šalies šiaurės rytus) patogenų populiacijai daugiausia atstovauja A1 poravimosi tipas (Harbaoui et al., 2014).
Čia dominuoja kloninė linija NA-01. Apskritai kloninių linijų dalis populiacijoje yra tik 43%. Rytų ir Pietų Afrikoje, kur sėklų importo apimtys yra nykstančios (Fry ir kt., 2009), P. infestans atstovauja tik dvi kloninės A1 tipo linijos - US-1 ir KE-1, o pastaroji aktyviai išstumia pirmąją ant bulvių ( Pule ir kt., 2012; Njoroge ir kt., 2016). Iki šiol abu šie genotipai turi pastebimą skaičių subkloninių variantų.
Australija
Pirmasis pranešimas apie vėlyvą bulvių puvimą Australijoje datuojamas 1907 m., O pirmoji epifitija, kurią, tikėtina, sukėlė gausūs lietūs vasaros mėnesiais, įvyko 1909–1911 m. (Drenth ir kt., 2002). Tačiau apskritai vėlyvasis pūtimas neturi reikšmingos ekonominės reikšmės šaliai. Sporadiniai vėlyvosios pūtimo protrūkiai, išprovokuoti oro sąlygų, užtikrinančių didelę drėgmę, neatsiranda dažniau kaip kartą per 5–7 metus ir yra lokalizuoti daugiausia Tasmanijos šiaurėje ir Viktorijos centre. Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta, leidinių, skirtų Australijos P. infestans populiacijos struktūrai tirti, praktiškai nėra. Naujausia turima informacija yra 1998–2000 m. (Drenth ir kt., 2002). Autorių teigimu, Viktorijos valstijos gyventojai buvo kloninė linija US-1.3, kuri netiesiogiai patvirtino šio genotipo migraciją iš JAV. Tasmanijos egzemplioriai buvo klasifikuojami kaip AU-3, kurie skiriasi nuo genotipų, tuo metu buvusių kitose pasaulio vietose.
Vėlyvosios maros vystymosi ypatybės Rusijoje
Europoje infekcija buvo užkrėsta ligotais sėkliniais gumbais, dirvožemyje žiemojančiomis oosporomis, taip pat zoosporangijomis, kurias atnešė vėjas iš augalų, išaugintų iš peržiemotų gumbų pernykščiuose laukuose („savanorių“ augaluose), arba ant iškastų krūvų. gumbų laikymo žymė. Iš jų augalai, auginami ant išmestų gumbų krūvos, laikomi pavojingiausiu infekcijos šaltiniu. ten daigintų gumbų skaičius dažnai būna didelis, o zoosporangijas iš jų galima nešti dideliais atstumais. Kiti šaltiniai (oosporos, „savanorių“ augalai) nėra tokie pavojingi, nes nėra įprasta augalus auginti tuose pačiuose laukuose dažniau nei kartą per 3-4 metus. Infekcija iš sergančių sėklų gumbų taip pat yra minimali dėl geros sėklų kokybės kontrolės sistemos.
Apskritai skiepų kiekis Europos populiacijose yra ribotas, todėl epidemijos didėjimas yra gana lėtas ir jį galima sėkmingai kontroliuoti naudojant cheminius fungicidinius preparatus. Pagrindinis uždavinys Europos sąlygomis yra kova su infekcija toje fazėje, kai prasideda masinis zoosporangijos sklaida nuo paveiktų augalų.
Rusijoje padėtis yra kardinaliai kitokia. Didžioji dalis bulvių ir pomidorų derliaus užauginama nedideliuose privačiuose soduose; apsauginės priemonės jiems iš viso netaikomos, arba fungicidinis gydymas atliekamas per mažai ir prasideda po to, kai viršūnėse atsiranda vėlyvasis pūtimas. Todėl privatūs daržovių sodai veikia kaip pagrindinis infekcijos šaltinis, iš kurio zoosporangijas vėjas neša į komercinius želdinius. Tai patvirtina mūsų tiesioginiai stebėjimai Maskvoje, Brjanske, Kostromoje, Riazanės regionuose: privačių sodų augalų pažeidimai pastebimi dar prieš pradedant fungicidų gydymą komerciniuose želdiniuose. Vėliau didelių laukų epidemija sulaikoma naudojant fungicidinius preparatus, o privačiuose soduose sparčiai vystosi vėlyvasis pūtimas.
Netinkamo ar „biudžetinio“ komercinių sodinimo būdų atveju laukuose taip pat atsiranda vėlyvosios žarnos židinių; vėliau jie aktyviai vystosi, apimdami vis didesnes sritis (Elansky, 2015). Infekcija privačiuose soduose daro didelę įtaką komercinių laukų epidemijoms. Visuose Rusijos bulvių auginimo regionuose bulvių užimamas plotas privačiuose soduose yra kelis kartus didesnis nei bendras didžiųjų gamintojų laukų plotas. Tokioje aplinkoje privatūs daržovių sodai gali būti vertinami kaip pasaulinis sėklų išteklius komerciniams laukams. Pabandykime nustatyti tas savybes, kurios būdingos privačių sodų padermių genotipams.
Sodinant maistines bulves, pomidorų sėklas, gautas iš abejotinų užsienio gamintojų, ne sėklos ir karantino kontrolę, ilgalaikį bulvių ir pomidorų auginimą tose pačiose vietovėse, netinkamą fungicidų gydymą ar visišką jų nebuvimą privataus sektoriaus gyventojai sukelia sunkias epifitus. kryžminimas, hibridizacija ir oosporų susidarymas privačiuose soduose. Dėl to pastebima labai didelė patogeno genotipinė įvairovė, kai beveik kiekviena padermė yra unikali savo genotipu (Elansky et al., 2001, 2015). Sodinant įvairios genetinės kilmės sėklines bulves, mažai tikėtina, kad atsiras kloninės linijos, kurios specializuojasi tam tikros veislės puolimui. Tokiu atveju pasirinktos padermės išsiskiria universalumu, palyginti su paveiktomis veislėmis, daugumoje jų yra beveik maksimalus virulentiškumo genų skaičius. Tai labai skiriasi nuo „kloninių linijų“ sistemos, būdingos dideliems žemės ūkio įmonių laukams, kuriuose tinkamai įrengta apsaugos nuo vėlyvojo pūtimo sistema. „Kloninės linijos“ (kai visus vėlyvosios ligos sukėlėjo atmainas lauke vaizduoja vienas ar keli genotipai) yra visur, kur bulvių auginimą vykdo tik dideli ūkiai: JAV, Nyderlandai, Danija ir kt. Anglijoje, Airijoje, Lenkijoje, kur tradiciškai paplitę ir namų ūkio sklypai. bulvių auginimas, privačiuose soduose taip pat yra didesnė genotipinė įvairovė. 20-ojo amžiaus pabaigoje „kloninės linijos“ buvo plačiai paplitusios Azijos ir Tolimuosiuose Rusijos regionuose (Elansky ir kt., 2001), o tai, matyt, atsirado dėl tų pačių veislių bulvių naudojimo tik sodinimui. Pastaruoju metu padėtis šiuose regionuose taip pat pradėjo keistis link didėjančios populiacijų genotipinės įvairovės.
Intensyvaus gydymo fungicidiniais preparatais trūkumas turi dar vieną, tiesioginę pasekmę - soduose nėra kaupiamų atsparių štamų. Iš tiesų, mūsų rezultatai rodo, kad metalaksilui atsparios padermės privačiuose soduose randamos daug rečiau nei komerciniuose želdiniuose.
Arti bulvių ir pomidorų sodinimo būdai, būdingi privatiems sodams, palengvina padermių migraciją tarp šių kultūrų, todėl pastarąjį dešimtmetį tarp iš bulvių išskiriamų padermių buvo padermių, turinčių atsparumo vyšnių pomidorų veislėms geną (T1), anksčiau būdinga tik pomidorų "padermės. Padermės, turinčios T1 geną, daugeliu atvejų yra labai agresyvios bulvėms ir pomidorams.
Pastaraisiais metais vėlyvasis pomidorų pūtimas daugeliu atvejų pradėjo pasirodyti anksčiau nei ant bulvių. Pomidorų daigus gali užkrėsti oosporos dirvožemyje arba oosporos, esančios pomidorų sėklose arba prie jų prilipusios (Rubin et al., 2001). Per pastaruosius 15 metų parduotuvėse pasirodė daugybė nebrangių supakuotų sėklų, daugiausia importuotų, ir dauguma mažųjų gamintojų perėjo prie jų naudojimo. Sėklose gali būti padermių, kurių genotipai būdingi jų auginimo regionams. Ateityje šie genotipai bus įtraukti į seksualinį procesą privačiuose soduose, o tai lemia visiškai naujų genotipų atsiradimą.
Taigi galima teigti, kad privatūs sodai yra visuotinis „lydomasis puodas“, kuriame dėl apsikeitimo genetine medžiaga yra apdorojami esami genotipai ir atsiranda visiškai nauji. Tuo pačiu metu jų pasirinkimas vyksta tokiomis sąlygomis, kurios labai skiriasi nuo sukurtų bulvėms dideliuose ūkiuose: fungicidinės spaudos nebuvimo, veislių sodinimo vienodumo, augalų, kuriuos paveikė įvairios virusinės ir bakterinės infekcijos formos, pomidorų ir laukinių nakvišų artumo, aktyvaus kryžminimo ir oosporos susidarymo, galimybės kad oosporos kitais metais veiktų kaip infekcijos šaltinis.
Visa tai lemia labai didelę namų ūkių genotipinę įvairovę. Esant epifitinėms sąlygoms, vėlyvoji mara labai greitai plinta daržovių soduose ir išsiskiria didžiulis sporų kiekis, kuris skrenda į netoliese esančius komercinius želdinius. Tačiau patekusios į komercinius laukus su tinkama žemės ūkio technologijos ir cheminės apsaugos sistema, atkeliavusios sporos praktiškai neturi galimybės pradėti epifitotikos lauke, o tai yra dėl to, kad nėra kloninių linijų, kurios būtų atsparios fungicidams ir būtų specializuotos auginamai veislei.
Kitas pirminio sėklos šaltinis gali būti ligoti gumbai, įstrigę komerciniuose daiguose. Šie šakniagumbiai paprastai buvo auginami laukuose, kuriuose naudojamos geros žemės ūkio technologijos ir intensyvi cheminė apsauga. Gumbus užkrėstų izoliatų genotipai yra pritaikyti jų pačių veislių vystymuisi. Šios veislės yra žymiai pavojingesnės komerciniam sodinimui nei inokuliatas, kilęs iš privačių sodų. Mūsų prielaidą patvirtina ir mūsų tyrimų rezultatai. Gyventojai, izoliuoti nuo didelių laukų su tinkamai atliekama chemine apsauga ir geromis žemės ūkio technologijomis, nesiskiria didele genotipų įvairove. Dažnai tai yra kelios kloninės linijos, kurios yra labai agresyvios.
Komercinės sėklinės medžiagos padermės gali patekti į daržovių sodų populiacijas ir dalyvauti juose vykstančiuose procesuose. Tačiau daržovių sode jų konkurencingumas bus daug mažesnis nei komerciniame lauke, ir netrukus jie nustos egzistuoti kloninės linijos pavidalu, tačiau jų genai gali būti naudojami „sodo“ populiacijoje.
Infekcija, atsirandanti ant „savanorių“ augalų ir sunaikintų gumbų krūvos derliaus nuėmimo metu, Rusijai nėra tokia aktuali, nes Pagrindiniuose Rusijos bulvių auginimo regionuose pastebimas gilus žiemos dirvožemio užšalimas, o dirvožemyje žiemojusių gumbų augalai retai vystosi. Be to, kaip rodo mūsų eksperimentai, vėlyvosios ligos sukėlėjas neišgyvena esant neigiamai temperatūrai net ir gumbuose, kurie išlaikė savo gyvybingumą. Sausojoje zonoje, kur auginamos ankstyvosios bulvės, vėlyvasis puvinys yra gana retas dėl sauso ir karšto auginimo sezono.
Taigi šiuo metu stebime P. infestans populiacijų skirstymąsi į „lauko“ ir „sodo“ populiacijas. Tačiau pastaraisiais metais buvo pastebėti procesai, vedantys į šių populiacijų genotipų konvergenciją ir įsiskverbimą.
Tarp jų galima pastebėti bendrą mažų gamintojų raštingumo padidėjimą, įperkamų mažų sėklinių bulvių pakuočių atsiradimą, fungicidinių preparatų plitimą mažose pakuotėse ir gyventojų „chemijos“ baimės praradimą.
Susiklosto situacijos, kai dėl energingo vieno tiekėjo aktyvumo ištisus kaimus apsodina tos pačios veislės sėklų gumbais ir aprūpina mažomis tų pačių pesticidų pakuotėmis. Galima manyti, kad tos pačios veislės bulvės bus randamos šalia esančiuose komerciniuose sodiniuose.
Kita vertus, kai kurios pesticidų prekybos įmonės propaguoja „biudžetines“ cheminio apdorojimo schemas. Šiuo atveju nepakankamai įvertinamas rekomenduojamų gydymo būdų skaičius ir siūlomi pigiausi fungicidai, o akcentuojama ne tam, kad būtų išvengta vėlyvojo pūtimo vystymosi iki viršūnių šienavimo, o tam tikras epifitotacijos vėlavimas, siekiant padidinti derlių. Tokios schemos yra ekonomiškai pagrįstos auginant maistines bulves iš žemos kokybės sėklinės medžiagos, kai iš esmės nekyla klausimas dėl didelio derliaus. Tačiau šiuo atveju, priešingai nei sodo populiacijose, išlygintas bulvių genetinis fonas prisideda prie specifinių fiziologinių rasių, kurios yra labai pavojingos šiai veislei, atrankos.
Apskritai bulvių auginimo „sodo“ ir „lauko“ metodų konvergencijos tendencijos mums atrodo gana pavojingos. Norint užkirsti kelią jų neigiamoms pasekmėms tiek namų, tiek prekybos sektoriuose, reikės kontroliuoti tiek sėklinių bulvių asortimentą, tiek privatiems savininkams siūlomų fungicidų asortimentą mažose pakuotėse, taip pat stebėti bulvių apsaugos schemas ir fungicidinių preparatų naudojimą komerciniame sektoriuje.
Privačiojo sektoriaus srityse intensyviai plėtojama ne tik vėlyvoji liga, bet ir „Alternaria“. Dauguma privačių sklypų savininkų nesiima specialių priemonių, kad apsisaugotų nuo „Alternaria“, suklaidindami „Alternaria“ vystymąsi dėl natūralaus viršūnių nykimo ar vėlyvojo liūto vystymosi. Todėl, imlioms veislėms masiškai išplėtojus „Alternaria“, buitiniai sklypai gali būti sėjamosios šaltinis komerciniuose želdiniuose.
Kintamumo mechanizmai
Mutacijos procesas
Kadangi mutacijų atsiradimas yra atsitiktinis procesas, vykstantis mažu dažniu, mutacijų atsiradimas bet kurioje vietoje priklauso nuo šio lokalizacijos mutacijų dažnio ir populiacijos dydžio. Tiriant P. infestans padermių mutacijų dažnį, paprastai nustatomas kolonijų, išaugusių selektyviose maistinėse terpėse, skaičius po apdorojimo cheminiais ar fiziniais mutagenais. Kaip matyti iš 8 lentelėje pateiktų duomenų, tos pačios padermės mutacijų dažnis skirtinguose lokusuose gali skirtis keliais dydžiais. Didelis atsparumo metalaksilui mutacijų dažnis gali būti viena iš jam atsparių padermių kaupimosi gamtoje priežasčių.
Savaiminių ar sukeltų mutacijų dažnis, apskaičiuotas remiantis laboratoriniais eksperimentais, ne visada atitinka natūraliuose populiacijose vykstančius procesus dėl šių priežasčių:
1. Esant asinchroniniam branduolio dalijimuisi, neįmanoma įvertinti mutacijų dažnio, tenkančio vienai branduolio kartai. Todėl daugumoje eksperimentų informacija pateikiama tik tiesiogiai apie mutacijų dažnį, neatskiriant dviejų mutacinių įvykių ir vieno įvykio po mitozės.
2. Vienpakopės mutacijos paprastai sumažina genomo pusiausvyrą, todėl kartu su naujos savybės įgijimu sumažėja ir bendras organizmo tinkamumas. Dauguma eksperimentiškai gautų mutacijų turi mažesnį agresyvumą ir nėra užfiksuotos natūraliose populiacijose. Taigi koreliacijos koeficientas tarp P. infestans mutantų atsparumo fenilamido fungicidams laipsnio ir augimo greičio dirbtinėje terpėje buvo vidutiniškai (-0,62), o bulvių lapų atsparumas fungicidams ir agresyvumas (-0,65) (Derevyagina ir kt. , 1993), o tai rodo žemą mutantų tinkamumą. Atsparumo dimetomorfui mutacijas taip pat lydėjo staigus gyvybingumo sumažėjimas (Bagirova ir kt., 2001).
3. Dauguma savaiminių ir sukeltų mutacijų yra recesyvinės ir eksperimentuose nepasireiškia fenotipiškai, tačiau sudaro paslėptą natūralių populiacijų kintamumo rezervą. Laboratorinių eksperimentų metu išskirtos mutantų padermės turi dominuojančias arba pusiau dominuojančias mutacijas (Kulish ir Dyakov, 1979). Akivaizdu, kad branduolinė diploidija paaiškina nesėkmingus bandymus gauti ultravioletinių spindulių poveikio mutantus, kurie yra virulentiški anksčiau atsparios veislės (McKee, 1969). Remiantis autoriaus skaičiavimais, tokios mutacijos gali pasireikšti mažesniu kaip 1: 500000 XNUMX dažniu. Recesyvinių mutacijų perėjimas į homozigotinę, fenotipiškai išreikštą būseną gali įvykti dėl seksualinės ar nelytinės rekombinacijos (žr. Toliau). Tačiau net ir šiuo atveju mutaciją gali užmaskuoti dominuojantys laukinio tipo branduolių aleliai cenoziniame (daugiabranduolyje) grybienoje ir fenotipiškai fiksuoti tik formuojantis vienbranduolėms zoosporoms.
8 lentelė. P. infestans mutacijų, susijusių su augimą slopinančiomis medžiagomis, dažnis veikiant nitrozometilurea (Dolgova, Dyakov, 1986; Bagirova et al., 2001)
Ryšys | Mutacijos dažnis |
Oksitetraciklinas | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | X 7,2 10-8 |
Streptomicinas | 8,3 x10-8 |
Trichotecinas | 1,8 10 x-8 |
Cikloheksimidas | 2,1 10 x-8 |
„Daakonil“ | <4 x 10-8 |
Dimetomorfas | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Gyventojų dydžiai taip pat vaidina lemiamą vaidmenį atsirandant spontaniškoms mutacijoms. Labai didelėse populiacijose, kuriose ląstelių skaičius N> 1 / a, kur a yra mutacijos greitis, mutacija nustoja būti atsitiktinis reiškinys (Kvitko, 1974).
Skaičiavimai rodo, kad vidutiniškai užkrėtus bulvių lauką (35 dėmės vienam augalui), vieno hektaro plote kasdien susidaro 8x1012 sporų (Dyakov ir Suprun, 1984). Akivaizdu, kad tokiose populiacijose yra visos mutacijos, kurias leidžia kiekvienos vietos mainų tipas. Net retą mutaciją, atsirandančią 10–9 dažniu, tūkstantis individų iš milijonų, gyvenančių viename hektare bulvių lauko, įgis. Mutacijoms, vykstančioms didesniu dažniu (pavyzdžiui, 10–6), tokioje populiacijoje įvairios porinės mutacijos gali pasireikšti kasdien (vienu metu dviem lokusuose), t. mutacinis procesas pakeis rekombinaciją.
Migracijos
P. infestans žmonėms yra žinomi du pagrindiniai migracijos tipai: uždaryti atstumus (bulvių lauke ar kaimyniniuose laukuose), plintant zoosporangijas oro srovėmis ar lietaus purškalais, ir į didelius atstumus - sodinant gumbus ar gabenamus pomidorų vaisius. Pirmasis metodas numato ligos židinio išplėtimą, antrasis - naujų židinių sukūrimas toli nuo pirminio esančiose vietose.
Infekcijos plitimas pomidorų gumbais ir vaisiais ne tik prisideda prie ligos atsiradimo naujose vietose, bet ir yra pagrindinis genetinės įvairovės šaltinis populiacijose. Maskvos regione auginamos bulvės, atvežtos iš skirtingų Rusijos ir Vakarų Europos regionų. Pomidorų vaisiai atvežami iš pietinių Rusijos regionų (Astrachanės sritis, Krasnodaro sritis, Šiaurės Kaukazas). Pomidorų sėklos, kurios taip pat gali būti infekcijos šaltiniais (Rubin ir kt., 2001), taip pat importuojamos iš pietinių Rusijos regionų, Kinijos, Europos šalių ir kitų šalių.
Remiantis E. Mayr (1974) skaičiavimais, genetiniai pokyčiai vietinėje populiacijoje, kuriuos sukelia mutacijos, retai viršija 10-5 vienoje vietoje, tuo tarpu atvirose populiacijose mainai dėl priešingo genų srauto yra bent 10-3 - 10-4.
Migracija užkrėstais gumbais yra atsakinga už P. infestans patekimą į Europą, išplitusią į visus pasaulio regionus, kuriuose auginamos bulvės; jie sukėlė rimčiausius gyventojų pokyčius. Vėlyvasis bulvių maras Rusijos imperijos teritorijoje pasirodė beveik tuo pačiu metu, kai jis pasirodė Vakarų Europoje.
Kadangi liga pirmą kartą buvo pastebėta 1846–1847 m. Baltijos šalyse ir tik vėlesniais metais išplito Baltarusijoje ir šiaurės vakariniuose Rusijos regionuose, jos Vakarų Europos kilmė yra akivaizdi. Pirmasis vėlyvosios pūtimo šaltinis Senajame pasaulyje nėra toks akivaizdus. Hipotezė, kurią sukūrė Fry ir kt. (Fry ir kt., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin ir kt., 1994), rodo, kad parazitas pirmiausia atkeliavo iš Meksikos į Šiaurės Ameriką, kur jis pasklido pasėliais, o po to buvo gabenamas į Vakarų Europą. (7 pav.).
Dėl pasikartojančio dreifo (dvigubas „butelio kaklo“ poveikis) į Europą pateko pavieniai klonai, kurių palikuonys sukėlė pandemiją visoje Senojo pasaulio teritorijoje, kur auginamos bulvės. Kaip įrodymą šiai hipotezei autoriai nurodo, visų pirma, tik vieno tipo poravimosi atvejus (A1) ir, antra, tiriamų įvairių regionų padermių genotipų homogeniškumą (visi jie yra pagrįsti molekuliniais žymenimis, įskaitant 2 izozimo lokusus, DNR pirštų atspaudų modelius ir mitochondrijų DNR struktūra yra identiška ir atitinka JAV aprašytą US-1 kloną). Tačiau kai kurie duomenys kelia abejonių dėl bent kai kurių nurodytos hipotezės nuostatų. Analizuojant P. infestans mitochondrijų DNR, išskirtą iš herbario bulvių mėginių, užkrėstų per pirmąjį epifitinį periodą 40-aisiais, paaiškėjo, kad jie skiriasi mitochondrijų DNR struktūra nuo US-1 klono, kuris buvo bent jau ne vienintelis infekcijos šaltinis Europoje (Ristaino ir kt., 2001).
XX a. 80-aisiais vėlai pablogėjo padėtis. Įvyko šie pakeitimai:
1) Padidėjo vidutinis gyventojų agresyvumas, dėl kurio ypač paplito labiausiai kenksminga vėlyvosios pūtimo forma - lapkočių ir stiebų pažeidimai.
2) Vėlyvosios bulvės atsiradimo laikas pasikeitė nuo liepos pabaigos iki liepos pradžios ir net iki birželio pabaigos.
3) A2 poravimosi tipas, kurio anksčiau nebuvo Senajame pasaulyje, tapo visur.
Prieš pokyčius įvyko du įvykiai: masiškai panaudotas naujas fungicidas metalaksilas (Schwinn ir Staub, 1980) ir Meksika tapo pasauline bulvių eksportuotoja (Niederhauser, 1993). Atsižvelgiant į tai, buvo nurodytos dvi populiacijos pokyčių priežastys - poravimosi tipo konversija veikiant metalaksilui (Ko, 1994) ir masinis naujų padermių su užkrėstais gumbais iš Meksikos įvedimas (Fry ir Goodwin, 1995). Nors poravimosi tipų perversmus veikiant metalaksilui, gavo ne tik Ko, bet ir dirbdami Maskvos valstybinio universiteto laboratorijoje (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), pageidautina antroji hipotezė. Kartu su antrojo poravimosi tipo atsiradimu rimti pokyčiai įvyko Rusijos P. infestans padermių genotipuose, įskaitant neutralius genus (izozimo ir RFLP lokusus), taip pat mitochondrijų DNR struktūrą. Šių pokyčių komplekso negalima paaiškinti metalaksilo veikimu, veikiau buvo masiškai importuojami nauji štamai iš Meksikos, kurie, būdami agresyvesni (Kato ir kt., 1997), išstūmė senąsias padermes (US-1), tapo populiacijose dominuojančiais. Europos populiacijų sudėtis pasikeitė per labai trumpą laiką - nuo 1980 iki 1985 metų (Fry ir kt., 1992). Buvusios SSRS teritorijoje „naujos padermės“ buvo rastos kolekcijose iš Estijos 1985 m., Tai yra anksčiau nei Lenkijoje ir Vokietijoje (Goodwin et al., 1994). Paskutinį kartą „sena padermė US-1“ Rusijoje nuo užkrėsto pomidoro buvo išskirta Maskvos srityje 1993 m. (Dolgova ir kt., 1997). Taip pat Prancūzijoje pomidorų sodinimuose iki 90-ųjų pradžios buvo rasta „senų“ štamų, tai yra po to, kai jie jau seniai išnyko ant bulvių (Leberton ir Andrivon, 1998). P. infestans padermių pokyčiai paveikė daugelį bruožų, tarp jų ir turinčius didelę praktinę reikšmę, ir padidino vėlyvosios pūtimo kenksmingumą.
Seksualinė rekombinacija
Norint, kad lytinė rekombinacija prisidėtų prie kintamumo, pirmiausia reikia, kad populiacijoje būtų dviejų rūšių poravimosi santykis, artimas 1: 1, ir, antra, pirminis populiacijos kintamumas.
Poravimosi tipų santykis labai skiriasi skirtingose populiacijose ir net skirtingais metais vienoje populiacijoje (9,10, 90 lentelė). Tokių drastiškų poravimosi tipų populiacijose pokyčių priežastys (kaip, pavyzdžiui, Rusijoje ar Izraelyje praėjusio amžiaus 2002-ųjų pradžioje) nežinomos, tačiau manoma, kad taip yra dėl konkurencingesnių klonų įvedimo (Cohen, XNUMX).
Kai kurie netiesioginiai duomenys rodo seksualinio proceso eigą tam tikrais metais ir tam tikruose regionuose:
1) Maskvos srities populiacijų tyrimai parodė, kad 13 populiacijų, kuriose A2 poravimosi tipas buvo mažesnis nei 10%, bendra genetinė įvairovė, apskaičiuota trims izozimo lokusams, buvo 0,08 ir 14 populiacijų, kuriose A2 dalis viršijo 30%, genetinė įvairovė buvo dvigubai didesnė (0,15) (Elansky ir kt., 1999). Taigi, kuo didesnė lytinio akto tikimybė, tuo didesnė gyventojų genetinė įvairovė.
2) Ryšys tarp poravimosi tipų santykio populiacijose ir oosporų susidarymo intensyvumo pastebėtas Izraelyje (Cohen ir kt., 1997) ir Olandijoje
(Flier ir kt., 2004). Mūsų tyrimai parodė, kad populiacijose, kuriose A2 poravimosi tipo izoliatai sudarė 62, 17, 9 ir 6%, oosporos buvo rastos 78, 50, 30 ir 15% analizuotų bulvių lapų (turinčių 2 ar daugiau dėmių).
2 ar daugiau dėmių turinčiuose mėginiuose žymiai dažniau buvo oosporų, nei mėginiuose su 1 dėme (atitinkamai 32 ir 14% mėginių) (Apryshko et al., 2004).
Oosporos daug dažniau būdavo vidutinio ir apatinio bulvių augalo sluoksnio lapuose (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) Kai kuriuose regionuose buvo atrasti unikalūs genotipai, kurių atsiradimas susijęs su lytine rekombinacija. Taigi Lenkijoje 1989 m. Ir Prancūzijoje 1990 m. Homozigotiniai gliukozės-6-
fosfato izomerazė (GPI 90/90). Kadangi anksčiau 10 metų buvo susiduriama tik su 90/100 heterozigotomis, homozigotiškumas priskiriamas seksualinei rekombinacijai (Sujkowski ir kt., 1994). Kolumbijoje (JAV) yra paplitę izoliatoriai, derinantys A2 su GPI 100/110 ir A1 su GPI 100/100, tačiau 1994 m. Sezono pabaigoje (rugpjūčio 16 d. Ir rugsėjo 9 d.) - rekombinantinių genotipų padermės (A1 GPI 100/110 ir A2 GPI 100/100) (Miller ir kt., 1997).
4) Kai kuriose Lenkijos (Sujkowski ir kt., 1994) ir Šiaurės Kaukazo (Amatkhanova ir kt., 2004) populiacijose pirštų atspaudų DNR lokusų ir alozimo baltymų lokusų pasiskirstymas atitinka Hardy-Weinberg pasiskirstymą, kuris rodo
apie didelę seksualinės rekombinacijos indėlio įtaką populiacijų kintamumui. Kituose Rusijos regionuose nebuvo nustatyta atitiktis Hardy-Weinberg pasiskirstymui populiacijose, tačiau buvo parodytas ryšių pusiausvyros nebuvimas, rodantis kloninio dauginimosi vyraujantį skaičių (Elansky et al., 1999).
5) Genetinė įvairovė (GST) tarp skirtingų poravimosi tipų (A1 ir A2) padermių buvo mažesnė nei tarp skirtingų populiacijų (Sujkowski ir kt., 1994), o tai netiesiogiai rodo lytinius kryžius.
Tuo pačiu metu seksualinės rekombinacijos indėlis į gyventojų įvairovę negali būti labai didelis. Šis indėlis buvo apskaičiuotas Maskvos srities gyventojams (Elansky ir kt., 1999). Remiantis Lewontin (1979) skaičiavimais, „rekombinacija, galinti iš dviejų lokusų gaminti naujus variantus, kurių dažnis neviršija jų heterozigotumų sandaugos, tampa efektyvus tik tuo atveju, jei abiejų alelių heterozigotiškumo vertės jau yra didelės“.
Kai dviejų tipų poravimosi santykis, būdingas Maskvos regionui, yra lygus 4: 1, rekombinacijos dažnis bus 0,25. Tikimybė, kad peržengtos padermės bus heterozigotinės dviem iš trijų tirtų izozimo lokusų tirtose populiacijose, buvo 0,01 (2 padermės iš 177). Todėl dvigubų heterozigotų atsiradimo tikimybė dėl rekombinacijos neturėtų viršyti jų sandaugos, padaugintos iš kryžminimo tikimybės (0,25x0,02x0,02) = 10-4, t.y. seksualiniai rekombinantai paprastai nepatenka į tiriamą padermių mėginį. Šie skaičiavimai buvo atlikti populiacijoms iš Maskvos srities, kuriai būdingas gana didelis kintamumas. Monomorfinėse populiacijose, tokiose kaip Sibiro, lytinis procesas, net jei jis vyksta atskirose populiacijose, negali turėti įtakos jų genetinei įvairovei.
Be to, P. infestans būdingas dažnas chromosomų nesutapimas mejozėje, dėl kurio atsiranda aneuploidija (Carter ir kt., 1999). Tokie pažeidimai sumažina hibridų vaisingumą.
Parasexualinė rekombinacija, mitozinių genų konversija
Atliekant P. infestans padermių susiliejimo su atsparumo įvairiems augimo inhibitoriams mutacijomis eksperimentus, buvo nustatyta abiems inhibitoriams atsparių misolatų atsiradimo (Shattock ir Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Dviem augimo inhibitoriams atsparios padermės atsirado grybelio heterokariotizacijos metu ir šiuo atveju jos suskilo reprodukcijos metu mononuklinėse zoosporose (Judelson, Ge Yang, 1998) arba nesuskilo monozoosinėse palikuonyse, nes turėjo tetraploidinius (kadangi pradiniai izoliatai yra diploidiniai branduoliai) , 1979). Heterozigotiniai diploidai išsiskyrė labai mažu dažniu dėl haploidizacijos, chromosomų nesusijimo ir mitozės perėjimo (Poedinok ir kt., 1982). Šių procesų dažnį galima padidinti tam tikru poveikiu heterozigotiniams diploidams (pavyzdžiui, dygstančių sporų švitinimas UV spinduliais).
Nors vegetatyvinių hibridų, turinčių dvigubą atsparumą, susidaro ne tik in vitro, bet ir mutantų mišiniu užkrėstuose bulvių gumbuose (Kulish ir kt., 1978), gana sunku įvertinti parasexualinės rekombinacijos vaidmenį kuriant naujus genotipus populiacijose. Segregantų susidarymo dažnis dėl haploidizacijos, chromosomų nesusijimo ir mitozės kryžminimo be specialaus poveikio yra nereikšmingas (mažiau nei 10-3).
Heterozigotinių padermių homozigotinių segregantų atsiradimas gali būti pagrįstas tiek mitozės kryžminimu, tiek mitozės genų konversija, kuri P. sojae įvyksta dažniu nuo 3 x 10-2 iki 5 x 10-5 lokusui, priklausomai nuo padermės (Chamnanpunt et al. , 2001).
Nors heterokarionų ir heterozigotinių diploidų pasireiškimo dažnis pasirodė netikėtai didelis (siekiantis dešimtis procentų), šis procesas vyksta tik tada, kai iš to paties kamieno gautos mutantinės kultūros yra sujungtos. Naudojant skirtingas nuo gamtos išskirtas padermes, heterokariotizacija nevyksta (arba įvyksta labai mažai) dėl vegetatyvinio nesuderinamumo (Poedinok ir Dyakov, 1981; Anikina ir kt., 1997b; Cherepennikova-Anikina ir kt., 2002). Vadinasi, parasexualinės rekombinacijos vaidmenį galima sumažinti tik iki intrakloninės rekombinacijos heterozigotiniuose branduoliuose ir atskirų genų perėjimo į homozigotinę būseną be seksualinio proceso. Šis procesas gali turėti epidemiologinę reikšmę padermėse, kuriose yra recesyvinių ar pusiau dominuojančių fungicidų atsparumo mutacijų. Dėl parasexualinio proceso jo perėjimas į homozigotinę būseną padidins mutacijos nešėjo atsparumą (Dolgova, Dyakov, 1986).
Genų introgresija
Heterotelinės rūšys Phytophthora sugeba susikryžiuoti su hibridinių oosporų susidarymu (žr. Vorob'eva ir Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Natūralus dviejų Phytophthora rūšių hibridas buvo toks agresyvus, kad JK užmušė tūkstančius alksnių (Brasier ir kt., 1999). P. infestans gali pasitaikyti su kitomis genties rūšimis (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum ir kt.) Ant įprastų augalų ir dirvožemio, tačiau literatūroje yra mažai informacijos apie tarprūšinių hibridų galimybę. Laboratorinėmis sąlygomis buvo gauti hibridai tarp P. infestans ir P. Mirabilis (Goodwin ir Fry, 1994).
9 lentelė. A2 poravimosi tipo P. infestans padermių dalis įvairiose pasaulio šalyse laikotarpiu nuo 1990 iki 2000 m. (Pagal atviros literatūros šaltinių ir svetainių www.euroblight.net, www.eucablight.org duomenis)
Šalis | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Baltarusija | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgija | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ekvadoras | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estija | 8 (12) | ||||||||||
Англия | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Suomija | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
Prancūzija | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Vengrija | 72 (32) | ||||||||||
Airija | 4 (145) | ||||||||||
Šiaurė. Airija | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Nyderlandai | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Норвегия | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Peru | 0 (34, 1984–86) | 0 (287, 1997-98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Lenkija | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Шотландия | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Швеция | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Velsas | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korėja | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Kinija | 20 (142, 1995-98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbija | 0 (40, 1994-2000) | ||||||||||
Urugvajus | 100 (25, 1998-99) | ||||||||||
Marokas | 60 (108, 1997-2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Meksika (Toluka) | 28 (292, 1988-89) | 50 (389, 1997-98) |
10 lentelė. P. infestans štamų, turinčių A2 poravimosi tipą, dalis įvairiose pasaulio šalyse laikotarpiu nuo 2000 iki 2011 m.
Šalis | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Austrijoje | 65 (83) | ||||||||||
Baltarusija | 42 (78) | ||||||||||
Belgija | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Šveicarija | 89 (19) | ||||||||||
Čekija | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Vokietija | 95 (53) | ||||||||||
Danija | 48 (52) | ||||||||||
Ekvadoras | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estija | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Англия | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Suomija | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
Prancūzija | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Vengrija | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Šiaurė. Airija | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Nyderlandai | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Норвегия | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Peru | 0 (36) | ||||||||||
Lenkija | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Шотландия | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Швеция | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovakija | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Velsas | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korėja | 46 (26) | ||||||||||
Brazilija | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Kinija | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnamas | 0 (294, 2003-04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Populiacijų genotipinės sudėties dinamika
P. infestans populiacijų genotipinės sudėties pokyčiai gali atsirasti dėl naujų klonų migracijos iš kitų regionų, žemės ūkio praktikos (veislių pakeitimo, fungicidų naudojimo) ir oro sąlygų. Išorinė įtaka skirtingiems gyvenimo ciklo etapams daro įtaką skirtingiems klonams; todėl populiacijos kasmet patiria ciklinius atrenkamų genų dažnių pokyčius dėl pasikeitusio dominuojančio genų dreifo ir selekcijos vaidmens.
Veislės įtaka
Naujos veislės, turinčios veiksmingus vertikalaus atsparumo genus (R-genai), yra galingas selektyvus veiksnys, kuris P. infestans populiacijose parenka klonus su papildomais virulentiškumo genais. Jei bulvių veislėje nėra nespecifinio atsparumo, kuris slopina patogenų populiacijos augimą, populiacijoje dominuojančių klonų pakeitimo procesas vyksta labai greitai. Taigi po Maskvos regione išplitusios Domodedovsky veislės, turinčios R3 atsparumo geną, šios veislės virulentų klonų dažnis per vienerius metus padidėjo nuo 0,2 iki 0,82 (Dyakov, Derevjagina, 2000).
Tačiau virulentiškumo genų (patotipų) dažnio pokytis populiacijose įvyksta ne tik dėl kultūrinių bulvių veislių įtakos. Pavyzdžiui, Baltarusijoje iki 1977 m. Dominavo klonai su 1 ir 4 virulentiškumo genais, kuriuos sukėlė bulvių veislių auginimas su atsparumo genais R1 ir R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Tačiau XX a. 70-ųjų pabaigoje klonai pasirodė su skirtingais virulentiškumo genais ir jų deriniais, o bulvių selekcijoje (papildomo virulentiškumo genai) komplementarūs atsparumo genai niekada nebuvo naudojami (Ivanyuk ir kt., 2002). Tokių klonų atsiradimo priežastis, matyt, yra dėl infekcinės medžiagos migracijos į Europą iš Meksikos su bulvių gumbais. Namuose šie klonai vystėsi ne tik augintose bulvėse, bet ir laukinėse rūšyse, turinčiose įvairius atsparumo genus, todėl norint išgyventi tomis sąlygomis, būtina derinti daug genomoje esančių virulentiškumo genų.
Kalbant apie nespecifinio atsparumo veisles, jos, sumažindamos patogeno dauginimosi greitį, atitolina jo populiacijų evoliuciją, o tai, kaip jau minėta, yra skaičiaus funkcija. Kadangi agresyvumas yra poligeninis, klonai, kuriuose yra didesnis „agresyvumo“ genų skaičius, kaupiasi kuo anksčiau, tuo didesnis populiacijos dydis. Todėl labai agresyvios rasės nėra prisitaikymo prie nespecifinio atsparumo auginamų veislių produktas, bet, priešingai, dažniau aptinkamos labai imlių veislių, kurios yra parazitų sporų kaupėjai, sodinimuose.
Taigi Rusijoje agresyviausios P. Infestans populiacijos buvo nustatytos kasmetinių epifitų populiacijose (Sachalino, Leningrado ir Brjansko regionų populiacijos). Šių populiacijų agresyvumas pasirodė esąs didesnis nei Meksikos (Filippov et al., 2004).
Be to, atsparių veislių lapuose susidaro mažiau oosporų nei imliose (Hanson ir Shattock, 1998), tai yra nespecifinis veislės atsparumas taip pat sumažina parazito rekombinacijos galimybes ir alternatyvių žiemojimo būdų galimybę.
Fungicidų įtaka
Fungicidai ne tik sumažina fitopatogeninių grybų skaičių, t. turi įtakos jų populiacijų kiekybinėms charakteristikoms, tačiau jie taip pat gali pakeisti atskirų genotipų dažnius, t. įtakos kokybinei populiacijų sudėčiai. Tarp svarbiausių populiacijų, besikeičiančių veikiant fungicidams, rodikliai yra šie: atsparumo fungicidams pokyčiai, agresyvumo ir virulentiškumo pokyčiai bei veisimo sistemų pokyčiai.
Fungicidų įtaka gyventojų atsparumui ir agresyvumui
Šios įtakos laipsnį visų pirma lemia naudojamo fungicido tipas, kurį sąlygiškai galima suskirstyti į polisitą, oligositą ir monozitą.
Pirmasis apima daugumą kontaktinių fungicidų. Pasipriešinimą jiems (jei tai apskritai įmanoma) kontroliuoja daugybė labai silpnai ekspresyvių genų. Šios savybės lemia matomų populiacijos atsparumo pokyčių nebuvimą po gydymo fungicidais (nors kai kuriuose eksperimentuose buvo pasiektas tam tikras atsparumo padidėjimas). Grybų populiacija, išsaugota purškiant kontaktiniais fungicidais, susideda iš dviejų padermių grupių:
1) Padermės, išsaugotos vaisto negydomose augalų vietose. Kadangi kontakto su fungicidu nebuvo, šių padermių agresyvumas ir atsparumas nesikeičia.
2) Su fungicidu besiliečiančios padermės, kurių koncentracija sąlyčio taškuose buvo mažesnė nei mirtina. Kaip minėta pirmiau, šios populiacijos dalies atsparumas taip pat nesikeičia, tačiau dėl dalinio žalingo fungicido poveikio net subletalinėje koncentracijoje grybelinės ląstelės metabolizmui, bendrajam tinkamumui ir jo parazitiniam komponentui, agresyvumui, mažėjimui (Derevyagina ir Dyakov, 1990).
Taigi net nemirusi populiacija, patekusi į sąlytį su fungicidu, pasižymi silpnu agresyvumu ir negali būti epifitinių medžiagų šaltinis. Todėl kruopštus apdorojimas, dėl kurio sumažėja gyventojų, nesiliečiančių su fungicidu, dalis, yra apsaugos priemonių sėkmės sąlyga. Atsparumą oligosito fungicidams kontroliuoja keli adityvūs genai.
Kiekvieno geno mutacija sukelia tam tikrą atsparumo padidėjimą, o bendras atsparumo laipsnis atsiranda dėl tokių mutacijų pridėjimo. Todėl atsparumo padidėjimas vyksta laipsniškai. Pakopinio atsparumo padidėjimo pavyzdys yra atsparumo fungicidui dimetomorfui, kuris plačiai naudojamas bulvėms apsaugoti nuo vėlyvojo puvinio, mutacijos. Atsparumas dimetomorfui yra poligeninis ir priedinis. Vieno etapo mutacija šiek tiek padidina atsparumą.
Kiekviena paskesnė mutacija sumažina tikslinį dydį ir atitinkamai vėlesnių mutacijų dažnį (Bagirova ir kt., 2001). Vidutinis gyventojų atsparumas padidėja po daugkartinio gydymo oligosito fungicidu laipsniškai ir palaipsniui. Šio proceso greitį lemia mažiausiai trys veiksniai: atsparumo genų mutacijų dažnis, atsparumo koeficientas (mirtinos atsparios padermės dozės santykis su jautria) ir atsparumo genų mutacijų poveikis fitnesui.
Kiekvienos paskesnės mutacijos pasireiškimo dažnis yra mažesnis nei ankstesnės, todėl procesas turi slopinamąjį pobūdį (Bagirova ir kt., 2001). Tačiau jei populiacijoje vyksta rekombinacijos procesai (seksualiniai ar parasexualiniai), tuomet galima derinti įvairias tėvų mutacijas hibridiniame padermėje ir pagreitinti procesą. Todėl panmix populiacijos atsparumą įgyja greičiau nei agamic populiacijos, o pastarosiose populiacijos, neturinčios vegetacinio nesuderinamumo barjerų, greičiau nei populiacijos, kurias skiria tokios kliūtys. Šiuo atžvilgiu padermių buvimas populiacijose, kurios skiriasi poravimosi tipais, pagreitina atsparumo oligosito fungicidams įgijimo procesą.
Antrasis ir trečiasis veiksniai neprisideda prie greito dimetomorfui atsparių padermių kaupimosi populiacijose. Kiekviena paskesnė mutacija maždaug padvigubina atsparumą, kuris yra nereikšmingas, o kartu sumažina ir augimo greitį dirbtinėje aplinkoje, ir agresyvumą (Bagirova ir kt., 2001; Stem, Kirk, 2004). Galbūt todėl tarp natūralių P. infestans padermių praktiškai nėra atsparių štamų, net ir tų, kurie surinkti iš bulvių sodinimo vietų, apdorotų dimetomorfu.
Oligosito fungicidu gydytą populiaciją taip pat sudarys dvi padermių grupės: tos, kurios neturėjo sąlyčio su fungicidu ir todėl nepakeitė pradinių savybių (jei tarp šios grupės yra atsparių padermių, jos nesikaups dėl didesnio jautrių padermių agresyvumo ir konkurencingumo), ir padermės, kurios liečiasi su subletaline fungicido koncentracija. Tarp pastarųjų yra įmanoma kaupti atsparias padermes, nes čia jos turi pranašumų prieš jautrius.
Todėl naudojant oligositinius fungicidus svarbu ne tiek kruopštus gydymas, kiek didelė vaisto koncentracija, kelis kartus didesnė už mirtiną dozę, nes taikant laipsnišką mutagenezę, mutavusių padermių pradinis atsparumas yra mažas.
Galiausiai, atsparumo monozitų fungicidams mutacijos yra labai išraiškingos, tai yra, viena mutacija gali parodyti aukštą atsparumo lygį iki visiško jautrumo praradimo. Todėl populiacijų atsparumas padidėja labai greitai.
Tokių fungicidų pavyzdžiai yra fenilamidai, įskaitant dažniausiai naudojamą fungicidą - metalaksilą. Atsparumo jam mutacijos įvyksta labai dažnai, o mutantų atsparumo laipsnis yra labai didelis - jis tūkstantį ar daugiau kartų viršija jautrią padermę (Derevyagina et al., 1993). Nors atsparių mutantų augimo greitis ir agresyvumas mažėja, atsižvelgiant į jautrių padermių mirtį nuo sisteminio fungicido, atsparių gyventojų skaičius sparčiai auga, o jos agresyvumas lygiagrečiai auga. Todėl po kelerių metų fungicido naudojimo atsparių padermių agresyvumas gali ne tik prilygti jautrių agresyvumui, bet ir jį viršyti (Derevyagina, Dyakov, 1992).
Poveikis lytinei rekombinacijai
Kadangi dažnas A2 poravimosi tipo paplitimas P. infestans populiacijose sutapo su intensyviu metalaksilo vartojimu prieš vėlyvą pūtimą, buvo pasiūlyta, kad metalaksilas sukelia poravimosi tipo konversiją. P. parasitica eksperimentiškai buvo įrodyta tokia konversija veikiant chloronebui ir metalaksilui (Ko, 1994). Vienintelis praėjimas ant terpės, kurioje buvo maža metalaksilo koncentracija, lėmė homotalio izoliatų atsiradimą iš P. infestans padermės, jautrios metalaksilui su A1 poravimosi tipu (Savenkova ir Cherepnikova-Anikina, 2002). Vėlesnių pasažų metu terpėse, kuriose buvo didesnė metalaksilo koncentracija, aptiktas ne vienas A2 poravimo tipo izoliatas, tačiau dauguma izoliatų, kryžminant su A2 izoliatais, o ne oosporomis, susidarė bjaurios grybienos sankaupos ir buvo sterilios. Atsparios A2 poravimosi tipo padermės perėjimai ant terpės su didele metalaksilo koncentracija leido mums nustatyti tris poravimosi tipo pokyčių formas: 1) visišką sterilumą, kai kryžminami su A1 ir A2 izoliatais; 2) homotalizmas (oosporų susidarymas monokultūroje); 3) A2 poravimosi tipo pavertimas A1. Taigi metalaksilas gali sukelti poravimosi tipų pokyčius P. infestans populiacijose ir dėl to lytinės rekombinacijos jose atsiradimą.
Įtakos vegetatyvinei rekombinacijai
Kai kurie atsparumo antibiotikams genai padidino hifinės heterokariotizacijos ir branduolinės diploidizacijos dažnį (Poedinok ir Dyakov, 1981). Kaip jau buvo minėta anksčiau, hfa heterokariotizacija susiliejus skirtingoms P. infestans padermėms įvyksta labai retai dėl vegetatyvinio nesuderinamumo šiame grybe reiškinio. Tačiau atsparumo kai kuriems antibiotikams genai gali turėti šalutinį poveikį, išreikštą vegetacinio nesuderinamumo įveikimu. Šią savybę turėjo 1S-1 mutantas streptomicino atsparumo genas. Tokių mutantų buvimas fitoftoros lauko populiacijose gali padidinti genų srautą tarp padermių ir pagreitinti visos populiacijos prisitaikymą prie naujų veislių ar fungicidų.
Tam tikri fungicidai ir antibiotikai gali paveikti mitozės rekombinacijos dažnį, o tai taip pat gali pakeisti genotipų populiacijose dažnį. Plačiai naudojamas fungicidas benomilas jungiasi su beta-tubulinu - baltymu, iš kurio yra pastatytos citoskeleto mikrovamzdeliai, ir taip sutrikdomi chromosomų išsiskyrimo procesai mitozės anafazėje, padidėja mitozės rekombinacijos dažnis (Hastie, 1970).
Fungicidas para-fluorofenilalaninas, vartojamas olandų ligoms gydyti guobose, turi tą pačią savybę. Parafluorfenilalaninas padidino rekombinacijos dažnį heterozigotiniuose diploiduose P. infestans (Poedinok ir kt., 1982).
Cikliniai populiacijų genotipinės sudėties pokyčiai P. infestans gyvenimo cikle
Klasikinis P. infestans vystymosi ciklas vidutinio klimato zonoje susideda iš 4 fazių.
1) Eksponentinio populiacijos augimo fazė (policiklinė fazė) su trumpomis kartomis. Šis etapas paprastai prasideda liepos mėnesį ir trunka 1,5-2 mėnesius.
2) Gyventojų augimo sustabdymo fazė dėl staigaus nepaveikto audinio dalies sumažėjimo ar nepalankių oro sąlygų atsiradimo. Šis etapas ūkiuose, kurie anksti atlieka derliaus nuėmimą prieš derliaus nuėmimą, iškrenta iš metinio ciklo.
3) Žiemojimo gumbuose fazė, kurią žymiai sumažino populiacijos dydis dėl atsitiktinio gumbų užkrėtimo, lėtas jų vystymasis, gumbų pakartotinio neužkrėtimo nebuvimas, paveiktų gumbų puvimas ir sunaikinimas normaliomis laikymo sąlygomis.
4) Lėtos dirvožemio ir daigų vystymosi fazė (monociklinė fazė), kurios metu generacijos trukmė gali siekti mėnesį ar daugiau (gegužės pabaigoje - liepos pradžioje). Paprastai šiuo metu sergančius lapus sunku nustatyti net specialiais stebėjimais.
Eksponentinio populiacijos augimo fazė (policiklinė fazė)
Daugybė stebėjimų (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) parodė, kad epifitotijos pradžioje vyrauja mažai virulentiški ir šiek tiek agresyvūs klonai, kuriuos vėliau pakeičia virulentiškesni ir agresyvesni. populiacijos agresyvumo augimo greitis yra didesnis, tuo mažiau atspari augalų šeimininko įvairovė.
Augant populiacijai, padidėja tiek selektyviai svarbių genų, įvežamų į komercines veisles (R1-R4), tiek selektyviai neutralių (R5-R11), koncentracija. Taigi populiacijose netoli Maskvos 1993 m. Vidutinis virulentiškumas nuo liepos pabaigos iki rugpjūčio vidurio padidėjo nuo 8,2 iki 9,4, o didžiausias padidėjimas buvo nustatytas selektyviai neutraliam virulentiškumo genui R5 (nuo 31 iki 86% virulentiškų klonų) (Smirnov, 1996 ).
Sumažėjus gyventojų skaičiui, sumažėja parazitinis gyventojų aktyvumas. Todėl depresijos metais tiek bendras lenktynių skaičius, tiek labai virulentiškų lenktynių skaičius yra mažesnis nei epifitinėse (Borisenok, 1969). Jei epifitozės aukštyje oro sąlygos pasikeičia į nepalankias vėlyvojo pūtimo metu ir sumažėja bulvių užkrėtimas, sumažėja ir labai virulentiškų bei agresyvių klonų koncentracija (Rybakova ir kt., 1987).
Genų, turinčių įtakos gyventojų virulentiškumui ir agresyvumui, dažnio padidėjimą gali lemti virulentiškesnių ir agresyvesnių klonų pasirinkimas mišrioje populiacijoje. Pasirinkimui pademonstruoti buvo sukurtas neutralių mutacijų analizės metodas, kuris sėkmingai buvo naudojamas mielių (Adams ir kt., 1985) ir Fusarium graminearum (Wiebe ir kt., 1995) populiacijose.
P. infestans lauko populiacijoje atsparių blastidinui S mutantų dažnis sumažėjo lygiagrečiai su populiacijos agresyvumo augimu, o tai rodo dominuojančių klonų pasikeitimą populiacijos augimo metu (Rybakova ir kt., 1987).
Žiemojimo fazė gumbuose
Žiemojant bulvių gumbuose, P. infestans padermių virulentiškumas ir agresyvumas mažėja, o virulentiškumas mažėja lėčiau nei agresyvumas (Rybakova ir Dyakov, 1990). Matyt, esant sąlygoms, kurios yra palankios sparčiam populiacijos augimui (r-selekcija), yra naudingi „papildomi“ virulentiškumo genai ir didelis agresyvumas, todėl epifitinių preparatų vystymąsi lydi virulentiškiausių ir agresyviausių klonų pasirinkimas. Aplinkos prisotinimo sąlygomis, kai svarbų vaidmenį vaidina ne dauginimosi greitis, o egzistavimo nepalankiomis sąlygomis nepalankios sąlygos (K-selekcija), „papildomi“ virulentiškumo ir agresyvumo genai sumažina fizinę būklę, o klonai su šiais genais pirmieji miršta, todėl vidutinis agresyvumas ir gyventojų virulentiškumas mažėja.
Vegetacijos fazė dirvožemyje
Šis etapas yra pats paslaptingiausias gyvenimo cikle (Andrivon, 1995). Jo egzistavimas yra postuluojamas grynai spekuliatyviai - dėl to, kad trūksta informacijos apie tai, kas ilgą laiką (kartais daugiau nei mėnesį) vyksta su ligos sukėlėju - nuo bulvių daigų atsiradimo iki pirmųjų ligos dėmių atsiradimo ant jų. Remiantis stebėjimais ir eksperimentais, grybelio elgesys šiuo gyvenimo laikotarpiu buvo rekonstruotas (Hirstas ir Stedmanas, 1960; Boguslavskaja, Filippovas, 1976).
Grybų sporuliacija gali susidaryti ant užkrėstų gumbų dirvožemyje. Susidariusios sporos dygsta hifomis, kurios ilgą laiką gali vegetuoti dirvožemyje. Pirminės (susiformavusios ant gumbų) ir antrinės (ant dirvoje esančio grybelio) sporos kapiliarinėmis srovėmis iškyla į dirvos paviršių, tačiau gebėjimą užkrėsti bulves įgyja tik tada, kai jos apatiniai lapai nusileidžia ir liečiasi su dirvos paviršiumi. Tokie lapai (būtent ant jų randamos pirmosios ligos dėmės) susidaro ne iš karto, o po ilgesnio bulvių viršūnių augimo ir vystymosi.
Taigi P. infestans gyvenimo cikle taip pat gali egzistuoti saprotrofinės vegetacijos fazė. Jei gyvenimo ciklo parazitinėje fazėje agresyvumas yra svarbiausias fizinio pasirengimo komponentas, tai saprotrofinėje fazėje atranka siekiama sumažinti parazitines savybes, kaip eksperimentiškai parodyta kai kuriems fitopatogeniniams grybams (žr. Carson, 1993). Todėl šiame ciklo etape agresyvios savybės turėtų būti prarastos intensyviausiai. Tačiau iki šiol nebuvo atlikta jokių tiesioginių eksperimentų, patvirtinančių pirmiau pateiktas prielaidas.
Sezoniniai pokyčiai daro įtaką ne tik P. infestans patogeninėms savybėms, bet ir atsparumui fungicidams, kuris auga policiklinėje fazėje (epifituojant), o žiemą laikant mažėja (Derevyagina et al., 1991; Kadish and Cohen, 1992). Ypač intensyvus atsparumo metalaksilui sumažėjimas pastebėtas tarp paveiktų gumbų pasodinimo ir pirmųjų ligos dėmių atsiradimo lauke.
Intraspecifinė specializacija ir jos raida
P. infestans sukelia dviejų komerciškai svarbių kultūrų - bulvių ir pomidorų - epidemijas. Epifitavimas ant bulvių prasidėjo netrukus po to, kai grybas pateko į naujas sritis. Pomidorų pralaimėjimas taip pat buvo pastebėtas netrukus po infekcijos atsiradimo ant bulvių, tačiau pomidorų epifitai buvo pastebėti tik po šimto metų - XX amžiaus viduryje. Štai ką Hallegli ir Niederhauseris rašo apie pomidorų pralaimėjimą JAV
(1962): „Maždaug 100 metų po sunkios 1845 m. Epifotijos nedaug ar beveik nebuvo bandoma gauti atsparių pomidorų veislių. Nors vėlyvas puvinys pirmą kartą buvo užfiksuotas pomidoruose jau 1848 m., Jis tapo rimto selekcininkų dėmesio objektu tik tada, kai 1946 m. Rusijos teritorijoje vėlyvasis pomidorų pūtimas buvo užregistruotas XIX a. „Ilgą laiką mokslininkai nekreipė dėmesio į šią ligą, nes ji nepadarė didelės ekonominės žalos. Tačiau 60–70 m. XX a. Vėlyvosios pomidos pomidorai pastebimi Sovietų Sąjungoje, daugiausia Žemutinės Volgos regione, Ukrainoje, Šiaurės Kaukaze, Moldovoje ... “(Balashova, 1979).
Nuo to laiko pomidorų maras iki vėlyvojo puvinio tapo kasmetinis, išplitęs visoje pramoninio ir naminio auginimo teritorijoje ir daro didžiulę ekonominę žalą šiems pasėliams. Kas nutiko? Kodėl pirmasis parazito atsiradimas ant bulvių ir epifitinis šio pasėlio pažeidimas įvyko beveik vienu metu ir kodėl prireikė šimtmečio, kol epifitozė atsirado ant pomidorų? Šie skirtumai palaiko Meksikos, o ne Pietų Amerikos infekcijos šaltinį. Jei Phytophthora infestans rūšis susiformavo kaip meksikiečių gumbavaisių Solanum genties rūšių parazitas, tai suprantama, kodėl taip stipriai nukentėjo auginamos bulvės, priklausančios tai pačiai genties daliai, kaip ir Meksikos rūšys, tačiau dėl to, kad nebuvo parazito, kuris nesukūrė specifinio ir nespecifinio atsparumo mechanizmų.
Pomidoras priklauso kitam genties skyriui, jo mainų rūšis turi reikšmingų skirtumų nuo gumbų rūšių, todėl, nepaisant to, kad pomidoras nėra už P. infestans maisto specializacijos ribų, jo nugalėjimo intensyvumas buvo nepakankamas dideliems ekonominiams nuostoliams.
Epifitinių pomidorų atsiradimą lemia rimti parazito genetiniai pokyčiai, kurie parazituojant padidino jo prisitaikomumą (patogeniškumą). Manome, kad pomidorų parazitavimui skirta nauja forma yra M. Gallegly aprašyta T1 rasė, turinti įtakos vyšnių pomidorų veislėms (Red Cherry, Ottawa), atsparioms bulvėse paplitusiai T0 rasei (Gallegly, 1952). Akivaizdu, kad mutacija (arba mutacijų serija) pavertė T0 lenktynes T1 lenktynėmis ir paskatino pasirodyti klonus, labai prisitaikiusius prie pomidorų nugalėjimo. Kaip dažnai nutinka, patogeniškumo padidėjimą vienam šeimininkui lydėjo jo sumažėjimas kitam, tai yra, atsirado pradinė, dar nebaigta tarpspecifinė specializacija - bulvėms (T0 rasė) ir pomidorams (T1 rasė).
Kokie yra šios prielaidos įrodymai?
- Pasitaiko ant bulvių ir pomidorų. Ant pomidorų lapų vyrauja T1 rasė, o bulvių lapuose - retai. Pasak S.F.Bagirovos ir T.A. Oreshonkova (neskelbta) Maskvos srityje 1991–1992 m. T1 lenktynėse bulvių pasodinimas buvo 0%, o pomidorų - 100%; 1993-1995 m. - atitinkamai 33% ir 90%; 2001 m. - 0% ir 67%. Panašūs duomenys gauti ir Izraelyje (Cohen, 2002). Bandymai užkrėsti bulvių gumbus T1 rasės izoliatais ir T0 ir T1 izoliatų mišiniu parodė, kad T1 rasės izoliatai blogai išsilaiko gumbuose ir yra pakeisti T0 rasės izoliatais (Dyakov et al., 1975; Rybakova, 1988).
2) T1 lenktynių dinamika pomidorų sodinimuose. Pirminę pomidorų lapų infekciją vykdo T0 rasės izoliatai, kurie dominuoja analizuojant infekciją pirmose ant lapų susidariusiose vietose. Tai patvirtina visuotinai priimtą parazitų migracijos schemą: pagrindinę bulvių infekcijos masę sudaro T0 rasė, tačiau nedidelis T1 klonų kiekis, išsaugotas bulvėse, patekęs į pomidorą, išstumia T0 rasę ir kaupiasi epifitinio laikotarpio pabaigoje. Taip pat gali būti, kad yra alternatyvus pomidorų lapų infekcijos šaltinis T1 rase, ne toks galingas kaip bulvių gumbai ir lapai, bet pastovus. Todėl šis šaltinis silpnai veikia pomidorus infekuojančios populiacijos genetinę struktūrą, tačiau vėliau lemia T1 rasės kaupimąsi (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994).
3) Agresyvumas bulvėms ir pomidorams. Dirbtinis pomidorų ir bulvių lapų užkrėtimas T0 ir T1 rasių izoliatais parodė, kad pirmieji yra agresyvesni bulvėms nei pomidorams, o antrieji agresyvesni pomidorams nei bulvėms. Šie skirtumai pasireiškia ne „savo“ rasės izoliatų išstūmimu iš mišrios populiacijos per lapus šiltnamyje (Dyakov et al., 1975) ir lauko sklypuose (Leberton et al., 1999); minimalios infekcinės apkrovos, latentinio laikotarpio, infekcinių dėmių dydžio ir sporų gamybos skirtumai (Rybakova, 1988; Dyakov et al., 1994; Legard et al., 1995; Forbes et al., 1997; Oyarzun et al., 1998; Leberton et et. al., 1999; Vega-Sanchez ir kt., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna ir kt., 2004).
T1 rasės izoliatų agresyvumas pomidorų veislėms, neturinčioms atsparumo genų, yra toks didelis, kad šie izoliatai sporoja ant lapų, kaip ant maistinės terpės, nekrotizuodami užkrėsto audinio (Dyakov et al., 1975; Vega-Sanchez et al., 2000).
4) bulvių ir pomidorų virulencija. T1 rasė veikia vyšnių pomidorų veisles, turinčias Ph1 atsparumo geną, o T0 rasė nėra pajėgi užkrėsti šių veislių, t. pasižymi siauresne virulencija. Diferenciatorių atžvilgiu
Bulvių R genai yra atvirkščiai susiję, t. iš pomidorų lapų išskirtos padermės yra mažiau virulentiškos nei „bulvių“ padermės (11 lentelė).
5) Neutralūs žymekliai. Neutralių žymenų analizė P. infestans populiacijose, parazituojančiose ant bulvių ir pomidorų, taip pat liudija apie daugialypę tarpspecifinę atranką. Brazilijos P. infestans populiacijose pomidorų lapų izoliatai priklausė kloninei linijai US-1, o bulvių lapai - BR-1 linijai (Suassuna ir kt., 2004). Floridoje (JAV) nuo 1994 m. Bulvėse pradėjo vyrauti US-90 klonas (daugiau nei 8%), o pomidoruose - US-11 ir US-17, o pastarojo izoliatai yra agresyvesni pomidorams nei bulvėms (Weingartner , Tombolato, 2004). Reikšmingi bulvių ir pomidorų izoliatų genotipų dažnių (DNR pirštų atspaudų) skirtumai nustatyti 1200 P. infestans padermių, surinktų JAV nuo 1989 iki 1995 metų (Deahl ir kt., 1995).
Taikant AFLP metodą, 74–1996 metais buvo galima atskirti 1997 štamas, surinktas iš bulvių ir pomidorų lapų. Prancūzijoje ir Šveicarijoje - 7 grupėse. Bulvių ir pomidorų padermės aiškiai nesiskyrė, tačiau „bulvių“ padermės genetiškai buvo įvairesnės nei „pomidorų“. Pirmieji buvo rasti visose septyniose grupėse, o antrieji - tik keturiuose, o tai rodo labiau specializuotą pastarojo genomą (Knapova ir Gisi, 2002).
6) Izoliacijos mechanizmai. Jei dviejų augalų augalų šeimininkių parazitų populiacijos vystosi siaurėjant specializacijai link savo „šeimininko“, tai atsiranda įvairių prieš ir postmeiotinių mechanizmų, kurie užkerta kelią populiacijų genetiniams mainams (Dyakov ir Lekomtseva, 1984).
Keli tyrimai ištyrė tėvų padermių šaltinio poveikį hibridizacijos efektyvumui. Kai Ekvadore buvo sukryžiuotos padermės, išskirtos iš skirtingų Solanum genties rūšių (Oliva ir kt., 2002), nustatyta, kad A2 laukinių nakvišų (kloninė linija EC-2) padermės su A3 poravimosi prasčiausiai kirto su pomidorų (EC linija) padermėmis. -1) ir efektyviausiai sukryžiuotas su bulvių kamienu (EC-XNUMX).
Nustatyta, kad visi hibridai nėra patogeniški. Autoriai mano, kad mažą hibridizacijos procentą ir patogeniškumo sumažėjimą hibriduose lemia postmeiotiniai populiacijų reprodukcinės izoliacijos mechanizmai.
Bandant Bagirova ir kt. (1998), daugybė bulvių ir pomidorų padermių buvo sukryžiuotos su T0 ir T1 rasių savybėmis. Labiausiai derlingi buvo T1xT1 padermių, išskirtų iš pomidorų, kryžiai (36 oosporos mikroskopo matymo lauke, 44% oosporų daigumo), mažiausiai veiksmingi buvo T0xT1 rasių kryžminimai, išskirti iš skirtingų šeimininkų (mažas besivystančių ir daigintų oosporų skaičius, didelis abortyvių ir neišsivysčiusių oosporų skaičius) ... Kryžių tarp T0 rasės izoliatų, izoliuotų iš bulvių, efektyvumas buvo vidutinis. Kadangi pagrindinė T0 rasės padermių dalis veikia bulves, ji turi patikimą žiemojimo šaltinį - bulvių gumbus, todėl oosporų, kaip žiemojančių infekcinių vienetų, svarba populiacijoms iš bulvių yra maža. Pritaikyta „pomidorų forma“ sugeba žiemoti pomidorą oosporų pavidalu (žr. Toliau), todėl išlaiko didesnį lytinio proceso produktyvumą. Dėl didelio vaisingumo T1 įgyja nepriklausomą pomidorų pirminės infekcijos potencialą. Knapovos ir kt. (Knapova ir kt., 2002) gautus rezultatus galima interpretuoti vienodai. Iš bulvių išskiriamų padermių kryžių su pomidorų padermėmis buvo didžiausias oosporų skaičius - 13,8 už kv. Mm. terpė (5–19 plitimu) ir tarpinis oosporų daigumo procentas (6,3, plintant 0–24). Kertant padermes, išskirtas iš pomidorų, buvo gautas mažiausias oosporų procentas (7,6 ir 4–12 paplitimas), o jų daigumas buvo didžiausias (10,8). Susikryžminus iš bulvių izoliuotų padermių, buvo gautas tarpinis oosporų skaičius (8,6 su dideliu duomenų išsisklaidymu - 0-30) ir mažiausias oosporų daigumo procentas (2,7). Taigi bulvių padermės yra mažiau derlingos nei pomidorų, tačiau kryžminimas tarp populiacijų davė ne blogesnius rezultatus nei intrapopuliacija. Gali būti, kad skirtumai su aukščiau pateiktais Bagirovos ir kt. Duomenimis. yra paaiškinami tuo, kad Rusijos tyrėjai dirbo su padermėmis, izoliuotomis XX a. 90-ųjų pradžioje, o Šveicarijos mokslininkai - su štamais, izoliuotais 90-ojo dešimtmečio pabaigoje.
Žemo vaisingumo pagrindas gali būti padermių heteroploidiškumas. Jei Meksikos populiacijose, kur lytinis procesas ir pirminė infekcija kiaušialąsčių palikuonimis yra reguliarūs, dauguma ištirtų P. Infestans padermių yra diploidinės, tai Senojo pasaulio šalyse pastebimas intrapopuliacinis ploidijos polimorfizmas (di-, tri- ir tetraploidinės padermės, taip pat heterokariotinės padermės su heteroploidiniais branduoliais). ir padermės, turinčios skirtingą poravimosi tipą, t. abipusiai vaisingos, skiriasi branduolio ploidija (Therrien ir kt., 1989, 1990; Whittaker ir kt., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Anteridijų ir oogonijų branduolių įvairovė gali būti mažo vaisingumo priežastis.
Kalbant apie branduolinius mainus tarp hifų anastomozių metu, to išvengti neleidžia vegetatyvinis nesuderinamumas, kuris aseksualias populiacijas skaido į daugelį genetiškai izoliuotų klonų (Poedinok ir Dyakov, 1987; Gorbunova ir kt., 1989; Anikina ir kt., 1997b).
7) Populiacijų konvergencija. Pirmiau pateikti duomenys rodo, kad hibridizacija tarp „bulvių“ ir „pomidorų“ P. infestans padermių yra įmanoma. Taip pat galima abipusė pakartotinė įvairių šeimininkų infekcija, nors ir su sumažėjusiu agresyvumu.
1993 m. Atlikus populiacijos žymenų tyrimus izoliuotose iš gretimų bulvių ir pomidorų laukų, paaiškėjo, kad maždaug ketvirtadalis izoliatų, išskirtų iš pomidorų lapų, buvo perkelti iš kaimyninio bulvių lauko (Dolgova ir kt., 1997). Teoriškai galima daryti prielaidą, kad populiacijų skirtumai tarp dviejų šeimininkų padidės ir paskatins atsirasti specializuotų intraspecifinių formų (f.sp. bulvių ir f.sp. pomidorų), ypač todėl, kad oosporos gali išlikti augalų liekanose (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) ir pomidorų sėklos (Rubin et al., 2001). Taigi pomidorai šiuo metu yra pavasario atsinaujinimo šaltinis, nepriklausantis nuo bulvių gumbų.
Tačiau viskas įvyko kitaip. Peržiemojimas oosporomis leido parazitui išvengti siauriausio savo gyvenimo ciklo etapo - monociklinės dirvožemio vegetacijos stadijos, kurios metu silpnėja parazitinės savybės, kurios vasarą palaipsniui atsistato policiklinėje fazėje.
11 lentelė. P. infestans padermių virulentiškumo genų ir bulvių diferenciatorių veislių dažniai
Šalis | Metai | Vidutinis virulentiškumo genų skaičius padermėse | autorius | |
iš bulvių | iš pomidorų | |||
Prancūzija | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton ir kt., 1999 m |
1996 | 4.8 | 3.6 | Lebertonas, Andrivonas, 1998 m | |
Prancūzija, Šveicarija | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 m |
JAV | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin ir kt., 1995 m |
JAV, Zap. Vašingtonas | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance ir kt., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ekvadoras | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun ir kt., 1998 m |
Izraelis | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusija, Mosk. regione | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnovas, 1996 m |
Rusija, skirtingi regionai | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaja ir kt. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Pirminės zoosporangijos ir zoosporos, kurios daigina oosporas, pasižymi dideliu parazitinio aktyvumo laipsniu, ypač jei oosporos susidarė partenogenetiškai paveikus padermės feromonais, turinčiais priešingą poravimosi tipą. Todėl infekcinė medžiaga ant pomidorų daigų, išaugintų iš sėklų, užkrėstų oosporomis, yra labai patogeninė pomidorams ir bulvėms.
Šie pokyčiai paskatino kitą gyventojų pertvarką, išreikštą šiais svarbiais pokyčiais epidemiologiniu požiūriu:
- Užkrėsti pomidorų daigai tapo svarbiu bulvių pirminės infekcijos šaltiniu (Filippovas, Ivanyukas, asmeninės žinutės).
- Epifitavimas ant bulvių pradėtas stebėti jau birželio mėnesį, maždaug mėnesiu anksčiau nei įprasta.
- Bulvių sodinimuose padidėjo T1 rasės procentinė dalis, su kuria anksčiau ten teko susidurti nereikšmingai (Ulanova ir kt., 2003).
- Iš pomidorų lapų išskirtos padermės nustojo skirtis nuo bulvių padermių virulentiškumu virulentiškumo genų bulvių diferenciatoriams ir agresyvumu ėmė viršyti „bulvių“ padermes ne tik pomidorų, bet ir bulvių atžvilgiu (Lavrova ir kt., 2003; Ulanova ir kt. , 2003).
Taigi vietoj divergencijos įvyko populiacijų konvergencija, atsirado viena populiacija dviejuose augaluose, pasižyminčiuose dideliu virulentiškumu ir agresyvumu abiem rūšims.
išvada
Taigi, nepaisant daugiau nei 150 metų intensyvaus P. infestans tyrimo, biologijoje, įskaitant šio sukėlėjo svarbiausių kultūrinių vienanarių augalų sukėlėjų populiacijos biologiją, daug kas lieka nežinoma. Neaišku, kaip atskirų gyvenimo ciklo etapų poveikis daro įtaką populiacijų struktūrai, kokie yra kanalizuoto agresyvumo ir virulentiškumo kintamumo genetiniai mechanizmai, koks yra reprodukcinės ir kloninės reprodukcijos sistemų santykis natūraliose populiacijose, kaip paveldimas vegetatyvinis nesuderinamumas, koks yra bulvių ir pomidorų vaidmuo pirminėje šių kultūrų infekcijoje ir koks jų poveikis parazitų populiacijų struktūrai. Iki šiol nebuvo išspręsti tokie svarbūs praktiniai klausimai kaip genetiniai parazito agresyvumo keitimo mechanizmai ar nespecifinio bulvių atsparumo erozija. Gilinant ir plečiant vėlyvųjų bulvių bulvių tyrimus, parazitas kelia naujus iššūkius tyrėjams. Tačiau eksperimentinių galimybių tobulinimas, naujų metodinių požiūrių į manipuliavimą genais ir baltymais atsiradimas leidžia tikėtis sėkmingo iškeltų klausimų sprendimo.
Straipsnis buvo paskelbtas žurnale „Bulvių apsauga“ (Nr. 3, 2017)