VALGYTI. Chudinova, V.A. Platonovas, A.V. Aleksandrova, S.N. Elanskis
Neseniai buvo įrodyta, kad Ascomycete grybas Ilyonectria crassa gali atakuoti bulvių gumbus. Šiame darbe pirmasis išnagrinėjo iš bulvių išskirtos I. crassa padermės biologines savybes ir atsparumą tam tikriems fungicidams. „Bulvių“ padermės rūšiai būdingų regionų sekos sutapo su anksčiau gautomis grybų, išskirtų iš narcizo, ženšenio, drebulės ir buko šaknų, lelijų svogūnėlių ir tulpių lapų, sekos. Matyt, daugelis laukinių ir sodo augalų gali būti I. crassa rezervatais. Tirta padermė užkrėtė pomidorų ir bulvių skilteles, tačiau neužkrėtė nei viso pomidoro vaisiaus, nei nepažeisto bulvių gumbų. Tai rodo, kad I. crassa yra žaizdos parazitas. Atsparumo fludioksoniliui, difenokonazolui ir azoksistrobinui įvertinimas maistinėje terpėje parodė didelį šių vaistų veiksmingumą.
EC50 rodiklis (fungicido koncentracija, sulėtinanti 2 kartus radialinio kolonijos augimo greitį, palyginti su nefungicidine kontrole) buvo lygus 0.4; atitinkamai 7.4 ir 4 mg/l. Fitopatologiškai vertinant bulvių gumbus ir kuriant augalų apsaugos priemones, reikėtų atsižvelgti į galimybę susirgti I. crassa sukelta liga.
Fitopatogeninių mikroorganizmų vystymasis lemia didelius nuostolius visuose bulvių auginimo ir laikymo etapuose. Planuojant apsaugos priemones, paprastai atsižvelgiama į gerai žinomus patogenus, tokius kaip Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora ir kt., Tačiau pastaraisiais metais pasirodo vis daugiau pranešimų. apie naujų fitopatogeninių mikroorganizmų atsiradimą ant bulvių. Jų biologija menkai ištirta, bulvėms naudojamų fungicidų veiksmingumas nuo jų nežinomas, diagnostikos metodai nesukurti. Masiškai vystant, jie gali padaryti didelę žalą bulvių pasėliui. Vienas iš šių mikroorganizmų yra pūlingasis grybas Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, kurį autoriai pirmą kartą aptiko ant bulvių gumbų (Chudinova ir kt., 2019).
Šiame darbe pateikiami I. crassa padermės, išskirtos iš bulvių gumbų, analizės rezultatai. Tirta I. crassa kolonijų ir grybienos struktūrų morfologija, rūšiai specifinių DNR sekcijų nukleotidų sekos, virulentiškumas bulvėms ir pomidorams, atsparumas kai kuriems populiariems fungicidams.
medžiagos ir metodai
Šiame darbe naudojama padermė I. crassa 18KSuPT2, išskirta 2018 metais iš užkrėsto bulvių gumbo, auginto Kostromos regione. Gumbą paveikė sausas puvinys, kurio ertmė padengta šviesiai rudos spalvos grybiena. Sterilia išpjaustymo adata grybelio grybiena buvo perkelta į Petri lėkštelę su agaro terpe (alaus misa 10%, agaras 1.5%, penicilinas 1000 vnt./ml). Indai buvo inkubuojami tamsoje 24 ° C temperatūroje.
Fotografavimui, sporų ir sporuliacijos organų dydžiui ir morfologijai įvertinti, buvo naudojamas Leica DM2500 šviesos mikroskopas su ICC50 HD skaitmenine kamera ir Leica M80 žiūroninis mikroskopas su IC80HD skaitmenine kamera (Leica Microsystems, Vokietija).
Norint išskirti DNR, grybelinė grybiena buvo auginama skystoje žirnių terpėje, po to užšaldoma skystame azote, homogenizuota, inkubuojama CTAB buferyje, išgryninta chloroformu ir du kartus plaunama 2% alkoholiu.
DNR ekstrahavimo metodas išsamiai aprašytas Kutuzovos ir kt. straipsnyje. (2017).
Norint nustatyti rūšies tapatumą molekuliniais metodais ir palyginti su kitomis žinomomis I. crassa padermėmis, PGR buvo atlikta su pradmenimis, kurie leido amplifikuoti rūšiai specifines DNR sritis: ITS1-5,8S-ITS2 (pradmenys ITS5/ITS4, White ir kt., 1990), b genų regionai -tubulinas (Bt2a/Bt2b, Glass ir Donaldson, 1995) ir transliacijos pailgėjimo faktorius 1α (tef1α) (pradmenys EF1-728F/EF1-986R, Carbone ir Kohn, 1999). Reikiamo ilgio amplikonai buvo išgauti iš gelio naudojant Evrogen CleanUp rinkinį. Amplifikuotos sritys buvo sekvenuotos naudojant BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, JAV) Applied Biosystems 3730 xl automatizuotame sekvencijoje (Applied Biosystems, CA, JAV). Gautos nukleotidų sekos buvo panaudotos atitikmens paieškai JAV Nacionalinio biotechnologijos informacijos centro (NCBI) GenBank duomenų bazėje. Filogenetinė analizė atlikta naudojant MEGA 6 programą (Tamura ir kt., 2013).
Virulentiškumas buvo nustatytas stambiavaisių pomidorų (Veislė Dubrava) ir bulvių gumbų (Gala) žalių vaisių. Be to, siekiant imituoti pažeistų vaisių ir gumbų pažeidimus, buvo naudojamos tų pačių vaisių ir gumbų griežinėliai. Gumbų griežinėliai buvo dedami į drėgnas kameras, kurios buvo Petri lėkštelės su šlapiu filtravimo popieriumi apačioje. Ant popieriaus buvo uždėta stiklinė stiklinė, ant kurios savo ruožtu dedamos gumbų ar vaisių griežinėliai. Į konteinerius su šlapiu filtravimo popieriumi apačioje buvo dedami ir sveiki gumbai bei vaisiai. Agaro gabalas (5 × 5 mm) su grybelio hifais buvo dedamas į pjūvio centrą (arba ant nepažeisto gumbų ar vaisiaus paviršiaus) su grybelio hifais po 5 dienų auginimo misos agare.
Grybų padermių atsparumas fungicidams buvo įvertintas laboratorinėmis sąlygomis agaro maistinėje terpėje. Tirėme jautrumą fungicidiniams vaistams Maxim, KS (veiklioji medžiaga fludioksonilis, 25 g/l), Quadris, KS (azoksistrobinas 250 g/l), Skor, CE (difenokonazolas 250 g/l) (Valstybinis katalogas..., 2020 m. ). Vertinimas atliktas Petri lėkštelėse ant misos-agaro terpės, pridedant tirtų vaistų, kurių veikliosios medžiagos koncentracija 0.1; 1; 10 ppm (mg/l) (fludioksoniliui ir difenokonazolui), 1; 10; 100 ppm (azoksistrobinui) ir terpėje be fungicido (kontrolė). Fungicidas buvo supiltas į išlydytą ir atšaldomą iki 60 °C terpę, po to terpė pilama į Petri lėkšteles. Agaro blokas su grybeline grybiena buvo dedamas į Petri lėkštelės centrą ir kultivuojamas 24 °C temperatūroje tamsoje. Po 7 dienų inkubacijos kolonijų skersmenys buvo išmatuoti dviem viena kitai statmenomis kryptimis; buvo apskaičiuoti kiekvienos kolonijos matavimo rezultatai. Eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais. Remiantis bandymų rezultatais, buvo apskaičiuotas EC50 indeksas, lygus fungicido koncentracijai, kuri perpus sumažino radialinio kolonijos augimo greitį, palyginti su nefungicidine kontrole.
Rezultatai ir DISKUSIJA
Petri lėkštelėse su misos agaru grybelis suformavo kolonijas su baltais dribsniais grybiena. Terpė po grybiena tapo raudonai ruda. Kai terpė išdžiūvo, grybelis suformavo dviejų tipų sporas ant pavienių konidioforų ir tas, kurios susikaupė į mažus sporodochius. Makrokonidijos yra pailgos, cilindrinės, su nuo vieno iki trijų pertvarų, vidutinis ilgis 27.2 µm, dydžių diapazonas nuo 23.2 iki 32.2 µm, plotis – iki 4.9 µm (1 pav.). Vidutinis mikrokonidijų ilgis yra 14.3 µm, o reikšmės svyruoja nuo 10.3 iki 18.1 µm, plotis – iki 4.0 µm. Visi makro- ir mikromorfologiniai požymiai patenka į Ilyonectria crassa rūšies variacijų diapazoną (Cabral ir kt., 2012).
Rūšiai specifinių DNR sričių (ITS, b-tubulino, TEF 1α) sekos visiškai sutapo su mūsų anksčiau tirtomis I. crassa padermių sekomis (Chudinova ir kt., 2019, 1 lentelė). Siekiant ištirti I. crassa paplitimą kituose regionuose ir išanalizuoti paveiktų pasėlių spektrą, GenBank duomenų bazėje buvo analizuojamos panašios DNR sekos (1 lentelė). Sutapimas svyravo nuo 86 iki 100%. Visų trijų I. crassa "bulvės" padermės DNR sričių sekos buvo identiškos padermių, išskirtų iš lelijų svogūnėlių ir narcizo šaknų Nyderlanduose ir iš ženšenio šaknų Kanadoje, sekoms. Mes negalėjome rasti jokių kitų I. crassa padermių su trimis analizuotomis panašiomis sekomis atvirose duomenų bazėse. Tačiau ITS ir b-tubulino sekų analizė atskleidė I. crassa buvimą ant tulpių lapų JK. Grybai su panašia ITS seka buvo nustatyti analizuojant drebulės šaknų mikobiotą Kanadoje ir buko šaknų mikobiotą Italijoje bei bulvių gumbų Saudo Arabijoje (1 lentelė). Šio tyrimo rezultatai rodo, kad I. crassa paplitimas yra pasaulinis ir gali atakuoti skirtingas augalų rūšis.
Nustačius patogeniškumą ant pomidorų ir bulvių griežinėlių 5 dieną, pažeidimo skersmuo siekė 1.5 cm. Tuo pačiu metu tirta padermė neužkrėtė nei viso pomidoro vaisiaus, nei nepažeisto bulvių gumbų. Tačiau pomidorų taurėlapių pažeidimai buvo pastebėti. Siekiant pašalinti užteršimo galimybę, grybelio izoliatas buvo išskirtas į gryną kultūrą iš grybienos, kuri išsivystė ant bulvių gumbų griežinėlio. Tai buvo visiškai identiška pirminei padermei. Atrodo, kad I. crassa yra žaizdos parazitas.
Sėklinių gumbų apdorojimas fungicidais prieš sodinimą gali sumažinti augalų ligų vystymąsi auginimo sezono metu. Norint parinkti veiksmingus fungicidus, svarbu įvertinti, kurie iš jų yra veiksmingi prieš I. crassa. Darbe tirtos plačiai naudojamos fungicidų veikliosios medžiagos – fludioksonilis, azoksistrobinas, difenokonazolas. Fludioksonilis yra dalis kelių mišrių preparatų, naudojamų sėkloms ir gumbams apdoroti prieš sodinimą. Fludioksonilis (Maxim) taip pat naudojamas sėkliniams gumbams apdoroti prieš laikant. Difenokonazolas ir azoksistrobinas taip pat yra įtraukti į daugybę preparatų, naudojamų sėklinei medžiagai apdoroti, taip pat į preparatus, skirtus vegetatyviniams augalams perdirbti (Valstybinis katalogas..., 2020).
I. crassa augimo greitis tirtas terpėse (2 pav.) su skirtingomis veikliųjų medžiagų koncentracijomis: fludioksoniliu (EC50 = 0.4 ppm), azoksistrobinu (EC50 = 4 ppm) ir difenokonazolu (EC50 = 7.4 ppm) (2 lentelė). . Šie vaistai gali būti laikomi labai veiksmingais prieš I. crassa, nes jų EC50 yra žymiai mažesnis nei rekomenduojama vaisto koncentracija darbiniame skystyje, naudojamame gumbams gydyti. Valstybinio katalogo... (2020) duomenimis, fludioksonilo koncentracija bulvių gumbų apdorojimo skystyje svyruoja nuo 500 iki 1000 ppm, azoksistrobino (vagos dugno apdorojimo skystyje) – 3750–9375 ppm, difenokonazolo. (skystyje vegetatyviniams augalams apdoroti) – 187.5– 625 ppm.
1 lentelė. Genbank duomenų bazėje esančių rūšiai specifinių 18KSuPT2 ir Ilyonectria crassa padermių sekų panašumas
Padermė | Augalas šeimininkas, išskyrimo vieta | „GenBank“ deponuoti eilės numeriai, panašumų procentas | Nuoroda | ||
ITS | β-tubulinas | TEF 1α | |||
17KSPT1 ir 18KSuPT2 | Bulvių gumbas, Kostromos sritis. | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova ir kt., 2019, šis darbas |
CBS 158/31 | Narcizo šaknys, Nyderlandai | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral ir kt., 2012 m |
CBS 139/30 | Lelijos svogūnėlis, Nyderlandai | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Ženšenio šaknis, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735/725 99.6 |
|
RHS235138 | Tulpės lapas, JK | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ŠD | Dentonas, Dentonas, 2014 m |
MT294410 | Aspen šaknys, Kanada | MT294410 100 | ŠD | ŠD | Ramsfield ir kt., 2020 m |
ER1937 | Buc, Italija | KR019363 99.65 | ŠD | ŠD | Tizzani, Haegi, Motta. Tiesioginis pateikimas |
KAUF19 | Bulvių gumbas, Saudo Arabija | HE649390 98.3 | ŠD | ŠD | Gashgari, Gherbawy, 2013 m |
ND = nedeponuotas
2 lentelė. Ilyonectria crassa atsparumas fungicidams
(veiklioji medžiaga) | EC50, ppm | ||||
3 dieną | 5 dieną | 7 dieną | |||
Kontroliuoti | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fzoksistrobinas) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioksonilis) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Rezultatas, EC (difenokonazolas) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Mūsų darbe I. crassa padermės buvo išskirtos iš bulvių gumbų Kostromos ir Maskvos regionuose (Chudinova ir kt., 2019). Analizuojant Saudo Arabijos bulvių gumbų mikobiotą, nustatyta didelė grybų padermių, kurių ITS sekos yra identiškos I. crassa, dalis (Gashgari ir Gherbawy, 2013). Matyt, I. crassa ant bulvių nėra tokia reta, kaip gali pasirodyti. Mūsų eksperimentai parodė, kad grybelis gali užkrėsti pažeistus pomidorų vaisius. Iš literatūros žinoma, kad I. crassa gali augti saprotrofiškai dirvožemyje (Moll ir kt., 2016), taip pat užkrėsti įvairius augalus, net ir tokius tolimus taksonomiškai kaip narcizai, lelijos, ženšenis, drebulės ir buko (1 lentelė). Matyt, daugelis laukinių ir sodo augalų gali būti I. crassa rezervatais. Tai, kas išdėstyta pirmiau, rodo, kad kuriant apsaugos priemones būtina atsižvelgti į tai, kad šis grybas gali pažeisti bulvių gumbus. Plačiai naudojami bulvių gumbų gydymui skirti preparatai, kurių sudėtyje yra fludioksonilio, azoksistrobino ir difenokonazolo, parodė didelį fungicidinį veiksmingumą prieš I. crassa.
Darbą parėmė Rusijos fundamentinių tyrimų fondas (grantos Nr. 20-016-00139).
Straipsnis publikuotas žurnale „Augalų apsaugos biuletenis“, 2020, 103(3)