D. Yu Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev.
Fitopatogeninis grybas Colletotrichum coccodes sukelia pavojingas bulvių ir pomidorų ligas, žinomas kaip antracnozė ir gumbų juodoji dėmė. Remiantis morfologinėmis savybėmis, juos dažnai sunku atskirti nuo kitų mikroorganizmų sukeltų ligų; Žalių pomidorų vaisiuose liga gali būti besimptomė, pasireiškianti tik sunokusiems raudoniems vaisiams. Norint greitai ir tiksliai diagnozuoti patogeną, siūloma realaus laiko PGR tyrimo sistema. Bandymo sistemai sukurti buvo nustatyta glicerolio trifosfato dehidrogenazės geno nukleotidų seka 45 C. coccodes padermėms, išskirtoms iš bulvių gumbų skirtinguose Rusijos regionuose.
Remiantis gautais rezultatais ir kitų rūšių panašių sekų analize, esančia GenBank duomenų bazėje, buvo sukurti rūšiai specifiniai pradmenys ir zondas C. coccodes. Sukurtos testų sistemos specifiškumui patikrinti buvo atlikta PGR su DNR, išskirta iš 15 skirtingų parazitinių ir saprotrofinių grybų, susijusių su pomidorų ir bulvių augalais (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani) grynų kultūrų. , Colletotrichum coccodes, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Colletotrichum coccodes DNR buvimas buvo aptiktas esant 20–27 slenksčio ciklui, o kitos rūšys buvo aptiktos po 40 ciklų arba nebuvo aptiktos. Testavimo sistema leidžia patikimai aptikti C. coccodes DNR koncentracijas, viršijančias 0.01 ng/mm3 analizuojamame PGR mišinyje. Naudojant sukurtą bandymų sistemą, C. coccodes buvimas tirtas pomidorų lapuose su grybelinių ligų simptomais ir bulvių gumbuose be išorinių ligos simptomų. Lapai su grybelinės infekcijos simptomais buvo surinkti iš dviejų skirtingų laukų Krasnodaro srityje, gumbai - iš laukų Kostromos, Maskvos, Kalugos ir Nižnij Novgorodo srityse. Krasnodaro srityje rastas vienas pomidoro lapas, kuriame buvo C. coccodes DNR; patikimas šio patogeno DNR buvimas nustatytas 5 stiebagumbių mėginiuose, augintuose Kostromos, Maskvos ir Kalugos regionuose.
įvedimas
Colletotrichum genties grybai yra pavojingi fitopatogenai, puolantys grūdus, daržoves, vaistažoles, daugiamečius vaisinius ir uoginius augalus. Viena iš visur paplitusių šios genties rūšių Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes yra antracnozės ir bulvių bei pomidorų juodadėmės sukėlėjas, sukelia daugelio kitų nakvišinių šeimos augalų ligas, įskaitant. piktžolės (Dillard, 1992). C. coccodes užkrečia visas požemines augalo dalis, stiebo pagrindus, lapus ir vaisius (Andrivon ir kt., 1998; Johnson, 1994). Ant užkrėstų bulvių gumbų odelės pastebimos pilkos dėmės su neaiškiai apibrėžtais kraštais, ant kurių aiškiai matomos juodos sporuliacijos ir mikrosklerocijos dėmės. Laikymo metu gumbų minkštime gali susidaryti opos su suminkštėjusiu turiniu, t.y. liga pereina į antracnozės fazę, tačiau tai yra itin reta.
Tuo pačiu metu pomidorų vaisiams būdingi antracnozės simptomai (opos, padengtos oda su mažais juodais taškeliais). Ant lapų C. coccodes pažeidimų simptomai atsiranda kaip tamsiai rudos dėmės, dažniausiai ribojamos geltonu audiniu (Johnson, 1994).
Išsivysčius juodoms dėmėms ant gumbų, sugadina jų išvaizdą, o tai ypač išryškėja parduodant nuplautas raudonžiedžiais bulves. Dėl žievelės atskyrimo susidaro per didelis garavimas ir padidėja sandėliavimo nuostoliai (Hunger ir McIntyre, 1979). Dėl kitų augalų organų pažeidimo prarandamas derlius, kuris buvo pastebėtas tiek atviro, tiek uždaro grunto sąlygomis (Johnson, 1994; Tsror ir kt., 1999). C. coccodes sukeltos ligos paplitusios beveik visuose pasaulio bulvių auginimo regionuose, įskaitant Rusiją (Leesa, Hilton, 2003; Belov ir kt., 2018). Kontroliuoti šias ligas sunku dėl nepakankamo esamų fungicidų veiksmingumo prieš C. coccodes ir atsparių veislių trūkumo (Read and Hide, 1995).
C. coccodes užkratas gali būti išsaugotas sėklų gumbuose (Read and Hide, 1988; Johnson ir kt., 1997), pomidorų sėklose (Ben-Daniel ir kt., 2010) ir ilgą laiką išlikti dirvoje bei ant augalų liekanų (Dillard, 1990; Dillard ir Cobb, 1993) ir piktžolėse (Raid ir Pennypacker, 1987). Daugelio autorių darbai (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson ir kt., 1997; Dillard, Cobb, 1993) parodė, kad bulvių ir pomidorų ligos išsivystymas labai priklauso nuo jų buvimo. inokuliato sėklos medžiagoje ir dirvožemyje. Todėl, siekiant sumažinti ligos nuostolius, būtina diagnozuoti (įskaitant kiekybinius) grybelio dauginimus sėklinėje medžiagoje, dirvožemyje, saugojimui laikomuose bulvių gumbuose ir pomidorų sėklose. Morfologinė diagnostika dirvožemyje ir augalinėje medžiagoje gali būti atliekama tik esant mikrosklerocijoms, kurių yra ir kitų rūšių grybuose.
Gumbų simptomai labai panašūs į sidabrinį šašą, kurį sukelia grybelis Helminthosporium solani. Colletotrichum coccodes ir Helminthosporium solani išskyrimas į grynąją kultūrą yra gana sunkus ir užtrunka ilgai dėl lėto augimo maistinėje terpėje. Norint greitai nustatyti Colletotrichum kokodus, būtina naudoti instrumentinius diagnostikos metodus. Patogiausias būdas yra polimerazės grandininė reakcija (PGR) ir jos modifikavimas – realaus laiko PGR. Šiuo metu Europoje ir JAV naudojama anglų mokslininkų (Cullen ir kt., 2002) sukurta testavimo sistema rDNR ITS1 regionui. Jo naudojimas taip pat parodė gerus Rusijos izoliatų analizės rezultatus (Belov ir kt., 2018). Tačiau C. coccodes yra labai įvairus ir jo aptikimas naudojant vieną DNR seką gali duoti klaidingai neigiamus rezultatus. Siekiant didesnio diagnostikos patikimumo, reikalinga kelių rūšiai specifinių DNR sekų analizė, todėl sukūrėme originalią tyrimo sistemą, kuri leidžia identifikuoti C. coccodes pagal gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės geno seką.
medžiagos ir metodai
Sukurtų bandymų sistemų efektyvumui ir specifiškumui įvertinti naudotos 15 rūšių grybų grynosios kultūros, autorių išskirtos iš paveiktų pomidorų lapų ir vaisių bei bulvių gumbų mėginių (1 lentelė). Izoliacijai buvo paimti augalų organai su grybelinės infekcijos simptomais, ne daugiau kaip vienas organas vienam krūmui.
Gumbo dalis su žievele, pomidoro vaisiaus griežinėlis arba pažeistas lapas buvo dedamos po žiūronu mikroskopu, po to grybiena, sporos ar audinio gabalėlis perkeliamas į agaro terpę (misos agarą) Petri lėkštelėje. su aštriai paaštrinta skrodimo adata. Izoliatai buvo laikomi ant pasvirusių agaro mėgintuvėlių 4 ° C temperatūroje.
Analizei skirti pomidorų lapų mėginiai su grybelinių ligų simptomais iš karto po surinkimo (lauke) buvo patalpinti į 70 % etilo alkoholį, kuriame buvo laikomi iki DNR išskyrimo. Bulvių gumbai buvo pristatyti į laboratoriją, nulupti (2 × 1 cm gabalas) ir užšaldyti –20°C temperatūroje. Jie buvo laikomi užšaldyti iki DNR ekstrahavimo.
Grynos grybų kultūros DNR ekstrakcijai buvo auginamos skystoje žirnių terpėje. Grybelio grybiena pašalinta iš skystos terpės, išdžiovinta ant filtravimo popieriaus, užšaldyta skystame azote, homogenizuota, inkubuota CTAB buferyje, išgryninta chloroformu, nusodinta izopropanolio ir 0.5 M kalio acetato mišiniu ir du kartus plaunama 2 % alkoholiu. . Gauta DNR buvo ištirpinta dejonizuotame vandenyje ir laikoma –70 °C temperatūroje (Kutuzova ir kt., 20). DNR koncentracija buvo matuojama naudojant HS DNR kiekybinio nustatymo rinkinį, skirtą dvigubai DNR Qubit 2017 (Qiagen, Vokietija). Konservuoti ir užšaldyti mėginiai buvo sumalti skystame azotu, tada DNR buvo išskirta, kaip aprašyta aukščiau (grynųjų grybų kultūrų grybienai).
1 lentelė. Šiame darbe naudotų grybų padermių kilmė
Grybų pavadinimas | augalas, organas | Pasirinkimo vieta |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | bulvių gumbas | Kostromos regionas, 1-osios lauko kartos bulvių gumbai, Red Scarlett veislė |
Colletotrichum coccodes 4 | bulvių lapų | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | bulvių gumbas | Magadano sritis, poz. Palapinė, bulvių gumbas |
Cladosporium fulvum | pomidoro lapelis | Maskvos sritis, stambiavaisis pomidoras |
Alternaria tomatophila | pomidorų vaisiai | perdavė Visos Rusijos augalų apsaugos tyrimų instituto Mikologijos ir fitopatologijos laboratorijos darbuotojai |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | pomidorų vaisiai | Krasnodaro sritis, Krymo rajonas, Slivkos veislė |
Fusarium oxysporum | kviečių šaknis | Maskvos sritis |
PGR buvo atlikta naudojant DTprime stiprintuvą (DNA-Technology). Norėdami atlikti PGR, naudojome originalius pradmenis ir zondą, skirtą konkrečiai glicerolio trifosfato dehidrogenazės geno rūšiai specifinei sričiai: pirminis pradmuo Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGCA, atvirkštinis pradmuo Coc280gdr – TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGGA – ( GGGCTGCTGCCG(p). Pradmenys sustiprina 1 bp sritį.
Reakcija apėmė 50 ng bendros DNR (analizuojant lapus ir gumbus) ir 10 ng (analizuojant DNR iš grynų grybų kultūrų). Reakcijos mišinys (35 μl) buvo padalintas į dvi dalis parafino sluoksniu: apatinėje (20 μl) buvo 2 μl 10 × reakcijos buferio (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4)2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1 % Tween-20), 0.5 mM kiekvieno deoksinukleotido trifosfato, 7 pmol kiekvieno pradmens ir 4 pmol hidrolizuojamo fluorescencinio zondo; viršutiniame buvo 1 μl 10 × PGR buferio ir 1 vienetas Taq polimerazės.
Mišinio atskyrimas parafinu leidžia ilgai laikyti mėgintuvėlius 5°C temperatūroje ir užtikrinti karštą PGR pradžią, kai jie 10 minučių buvo kaitinami aukštesnėje nei 80°C temperatūroje. PGR atlikta pagal šią programą: 94.0°C – 90 s (1 ciklas); 94.0°C – 30 s; 64.0°C – 15 s (5 ciklai); 94.0°C – 10 s; 64.0°C – 15 s (45 ciklai); 10.0°C – saugojimas.
Rezultatai ir DISKUSIJA
Glicerolio trifosfato dehidrogenazės geno sekos buvo nustatytos 45 padermėse, išskirtose iš lapų, stiebų, bulvių gumbų ir pomidorų vaisių (Kutuzova, 2018) skirtinguose Rusijos regionuose. Tirtos visų padermių sekos suskirstytos į 2 grupes, besiskiriančias dviem nukleotidais. Abiejų grupių atstovų nukleotidų sekos buvo deponuotos GenBank numeriais KY496634 ir KY496635.
Pradmenys coc70gdf, coc280gdr ir jų pagrindu sukonstruotas cocgdz zondas buvo patikrinti naudojant BLAST programą (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) visose glicerolio trifosfato dehidrogenazės genų sekose, prieinamose GenBank duomenų bazėje iš Colletotrichum genties rūšių ir kitų organizmų.
Kitų organizmų DNR regionų, labai homologiškų pradmenims ir zondui, nerasta.
Bandymų sistemos jautrumas buvo tiriamas naudojant skirtingų koncentracijų C. coccodes DNR mėginius, antracnozės paveikto bulvių lapo DNR (surinkta 2017 m. Mari El, Red Scarlett veislės) ir gumbų žieveles, paveiktas juodosios dėmės (surinktos m. Kostromos regionas, veislė Red Scarlett, 2 lentelė). Siekiant patvirtinti DNR buvimą bulvių gumbuose ir lapuose, iš jų buvo išskirtos C. coccodes padermės į grynąsias kultūras.
Tyrimo sistemos jautrumo analizės rezultatai rodo, kad pagal ją galima sėkmingai diagnozuoti C. coccodes DNR buvimą mėginyje, jei bendras jos kiekis PGR mišinyje yra didesnis nei 0.05 ng. To aptikimui visiškai pakanka, nes viename sklerociuje yra vidutiniškai 0.131 ng, o vienoje sporoje – apie 0.04 ng DNR (Cullen ir kt., 2002). Anglų grupės sukurta bandymų sistema (Cullen ir kt., 2002) parodė panašų jautrumą (slenkstinis ciklas 34 esant 0.05 ng DNR ir 37 esant 0.005 ng).
Natūralių mėginių, kuriuose yra C. coccodes, analizė visais atvejais leido patikimai nustatyti jo buvimą mėginyje (2 lentelė). Pasiūlytas DNR išskyrimo metodas pasirodė tinkamas ir natūralių augalų mėginių analizei.
2 lentelė. Siūlomos Colletotrichum coccodes identifikavimo bandymo sistemos jautrumo nustatymas realiuoju laiku PGR
Pavyzdys | DNR kiekis mėginyje*, ng | Slenkstinis ciklas | C. coccodes aptikimas |
---|---|---|---|
Colletotrichum kokodų grybiena | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Gumbų žievelė 1 | 50 | 32 | + |
Gumbų žievelė 2 | 50 | 30 | + |
Gumbų žievelė 3 | 50 | 31.5 | + |
bulvių lapų | 50 | 29.5 | + |
Pastaba. *PGR produktų mišinyje.
Bandymų sistemos specifiškumas buvo išbandytas su DNR mėginiais, išskirtais iš 15 rūšių grybų. Visas grybelio padermes autoriai išskyrė iš pažeistų ir sveikų pomidorų vaisių ir lapų bei bulvių gumbų; viena padermė buvo išskirta iš kviečių šaknų (1 lentelė). Tarp išskirtų iš vaisiaus paviršiaus taip pat yra rūšių, kurios nėra patogeniškos pomidorams (pvz., Phellinus ferrugineovelutinus).
Tyrimai parodė, kad C. coccodes DNR buvo aptikta esant 20–27 slenksčio ciklui, o kitos grybų rūšys nebuvo aptiktos arba nedavė signalo po 40 ciklo, o tai gali būti siejama su nespecifiniu triukšmo efektu (3 lentelė).
3 lentelė. Bandymo sistemos bandymai su įvairių rūšių grybais
Grybų pavadinimas | Slenkstinis ciklas |
Colletotrichum kokodai 1 | 20.9 |
C. kokodai 2 | 22.6 |
C. kokodai 3 | 23 |
C. kokodai 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
penicillium Sp. | > 40 |
Pastaba. *DNR kiekis visuose mėginiuose buvo 10 ng.
Sukurta bandymų sistema buvo panaudota C. coccodes identifikuoti pomidorų lapų mėginiuose su nekrotrofinių ligų sukėlėjų pažeidimo simptomais ir sėklinių bulvių gumbuose be matomų simptomų. Tyrimui buvo paimti įvairių veislių sėkliniai gumbai, auginami Kostromos, Maskvos, Kalugos ir Nižnij Novgorodo regionuose. C. coccodes DNR buvimas buvo laikomas patikimu mėginiuose, kuriuose slenkstinis ciklas neviršijo 35. Ši slenkstinė vertė buvo pasirinkta remiantis patikimu 0.05 ng C. coccodes DNR aptikimu (33.5 slenksčio ciklas, 2 lentelė) ir faktas, kad kai slenkstinis ciklas viršija 40, buvo diagnozuota kai kurių kitų grybų rūšių nespecifinė DNR. Taikant šį metodą, patikimas C. coccodes DNR buvimas buvo aptiktas 5 gumbų, užaugintų Kostromos, Maskvos, Kalugos regionuose, mėginiuose ir viename pomidorų lape iš Krasnodaro srities Yeisko rajono (4, 5 lentelės).
4 lentelė. Colletotrichum kokodų aptikimas ant bulvių gumbų*
Pavyzdžio numeris | Bulvių įvairovė | Augimo vieta | C. coccodes aptikimas | Slenkstinis ciklas |
---|---|---|---|---|
1 | Raudona Scarlet | Kostromos regionas | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Santė | Maskvos sritis | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Жуковский anksti | Maskvos sritis | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kalugos regionas | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantazija | Kalugos regionas | - | |
15 | Gala | Žemutinis Naugardas Regionas. | - | |
16 | - |
Pastaba. *DNR kiekis visuose mėginiuose buvo 50 ng.
5 lentelė. Colletotrichum kokodų aptikimas ant pomidorų lapų*
Pavyzdžio numeris | Augimo vieta | C. coccodes aptikimas | Slenkstinis ciklas |
---|---|---|---|
1 | Krasnodaro sritis, Krymo rajonas | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodaro sritis, Yeisko sritis | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
*DNR kiekis visuose mėginiuose buvo 50 ng.
Mūsų sukurta bandymų sistema jautrumu ir specifiškumu nenusileidžia sukurtai anglų mokslininkų (Cullen ir kt., 2002) ir tinka augalų mėginių analizei. Jo panaudojimas sėklinių gumbų analizei leido aptikti C. coccodes DNR gumbuose be išorinių pažeidimo požymių ir sėkmingai išanalizuoti lapų užkrėtimą.
Rusijoje iki šiol bulvių gumbai nebuvo ištirti dėl C. coccodes infekcijos. Pirmasis mūsų tyrimas parodė, kad iš 16 patikrintų sėklinių gumbų, auginamų skirtinguose Rusijos Federacijos regionuose, 5 yra C. coccodes. Tai rodo, kad bulvių gumbų juodoji dėmė yra dažna bulvių liga Rusijoje, o jos vaidmuo mažinant bulvių derliaus apimtį ir kokybę yra neįvertinamas.
Analizuojant pomidorų lapus, viename lape iš Krasnodaro srities Yeisk rajono buvo aptiktas patikimas C. coccodes DNR. Anksčiau tiriant pomidorų laukus pietų Rusijoje naudojant britų bandymų sistemą (Cullen ir kt., 2002), buvo nustatyti lapai, kuriuose yra C. coccodes, o kai kuriuose laukuose buvo nustatyta didelė dalis lapų, paveiktų C. coccodes (Belov ir kt. al., 2018). Krasnodaro ir Primorskio teritorijose bei Maskvos srityje aptikome pomidorų vaisių, iš kurių pavyko išskirti grynąsias C. coccodes kultūras. Gali būti, kad C. coccodes Rusijoje ant pomidorų išplitęs daug plačiau, nei manoma šiuo metu, o jo kenksmingumas taip pat neįvertinamas.
Taigi iki šiol sukaupta pakankamai informacijos apie platų C. coccodes paplitimą ant bulvių ir pomidorų.
Norint geriau suprasti šio grybelio vaidmenį vystant bulvių ir pomidorų ligas, būtina išsamiai stebėti jo paplitimą Rusijoje, tirti dirvožemio ir sėklų infekcijų bei juodųjų dėmių vaidmenį sandėliavimo nuostoliuose. PGR diagnostikos naudojimas gali žymiai palengvinti šį darbą, o vienu metu naudojant abi tyrimo sistemas, analizės tikslumas gerokai padidės.
Darbas buvo paremtas Rusijos mokslo fondo dotacija Nr. 18-76-00009.
Straipsnis publikuotas žurnale „Mikologija ir fitopatologija“ (t. 54, Nr. 1, 2020).